المواد العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) يمكنها تقليد بيئة الورم في المختبر. في سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة ، تمثل PDOs نموذجا لدراسة المؤشرات الحيوية والعلاجات الجديدة.
Organoids هي نماذج الورم الديناميكي 3D التي يمكن أن تنمو بنجاح من أنسجة ورم المبيض المشتقة من المريض ، أو الاستسقاء ، أو السائل الجنبي وتساعد في اكتشاف علاجات جديدة ومؤشرات حيوية تنبؤية لسرطان المبيض. تلخص هذه النماذج عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أنها تتطابق مع الورم الرئيسي من الناحية الشكلية والخلوية والكيميائية المناعية ووراثيا. وبالتالي ، فإن المواد العضوية تسهل البحث عن الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم وتتفوق على خطوط الخلايا. يصف البروتوكول الحالي طرقا متميزة لتوليد عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض من أورام المرضى والاستسقاء وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يتم فصل عينات المريض إلى معلقات خلوية عن طريق الهضم الميكانيكي والأنزيمي. ثم يتم طلاء الخلايا باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي (BME) ويتم دعمها بوسائط نمو محسنة تحتوي على مكملات خاصة بزراعة سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). بعد تشكيل المواد العضوية الأولية ، يمكن ل PDOs الحفاظ على ثقافة طويلة الأجل ، بما في ذلك المرور للتوسع في التجارب اللاحقة.
في عام 2021 ، تم تشخيص ما يقرب من 21,410 امرأة في الولايات المتحدة حديثا بسرطان المبيض الظهاري ، وتوفيت 12,940 امرأة بسبب هذا المرض1. على الرغم من إحراز تقدم كاف في الجراحة والعلاج الكيميائي ، إلا أن أكثر من 70٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم يطورون مقاومة العلاج الكيميائي ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة لعلاج هذا المرض الفتاك ونماذج تمثيلية موثوقة للبحوث قبل السريرية.
خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) التي تم إنشاؤها من أورام المبيض الأولية هي الأدوات الرئيسية المستخدمة في أبحاث سرطان المبيض. الميزة الرئيسية لخطوط الخلايا السرطانية هي توسعها السريع. ومع ذلك ، فإن ثقافتهم المستمرة تؤدي إلى تغيرات في النمط الظاهري والجيني تتسبب في انحراف خطوط الخلايا السرطانية عن عينة ورم السرطان الأولية الأصلية. نظرا للاختلافات الموجودة بين خط الخلايا السرطانية والورم الرئيسي ، فإن فحوصات الأدوية التي لها تأثيرات إيجابية في خطوط الخلايا تفشل في الحصول على نفس التأثيرات في التجارب السريرية2. للتغلب على هذه القيود ، يتم استخدام نماذج PDX. يتم إنشاء هذه النماذج عن طريق زرع أنسجة سرطان المبيض الطازجة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما هي في نماذج الجسم الحي ، فإنها تشبه بدقة الخصائص البيولوجية البشرية ، وبالتالي ، فهي أكثر تنبؤا بنتائج الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لها أيضا قيود كبيرة ، بما في ذلك التكلفة والوقت والموارد اللازمة لتوليدها4.
تقدم PDOs نموذجا بديلا للأبحاث قبل السريرية التي تتغلب على قيود كل من خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. تلخص PDOs ورم المريض والبيئة المكروية للورم ، وبالتالي توفر نموذجا قابلا للسحب في المختبر مثاليا للبحث قبل السريري2،3،5. تتمتع نماذج 3D هذه بقدرات التنظيم الذاتي التي تصمم الورم الرئيسي ، وهي ميزة لا يمتلكها نظرائهم في خط الخلايا ثنائي الأبعاد (2D). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن هذه النماذج تمثل وراثيا ووظيفيا الأورام الأم ، وبالتالي فهي نماذج موثوقة لدراسة العلاجات الجديدة والعمليات البيولوجية. باختصار ، إنها توفر إمكانات توسع وتخزين طويلة الأجل مماثلة لخطوط الخلايا ولكنها تشمل أيضا البيئة المكروية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا المتأصلة في نماذج الماوس 4,6.
يصف البروتوكول الحالي إنشاء PDOs من الأورام المشتقة من المريض ، والاستسقاء ، وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يمكن بعد ذلك توسيع مزارع PDO لأجيال متعددة واستخدامها لاختبار حساسية العلاج الدوائي والمؤشرات الحيوية التنبؤية. تمثل هذه الطريقة تقنية يمكن استخدامها لتخصيص العلاجات بناء على الاستجابات العلاجية ل PDOs.
سرطان المبيض مميت للغاية بسبب مرحلته المتقدمة في التشخيص ، فضلا عن التطور الشائع لمقاومة العلاج الكيميائي. تم إحراز العديد من التطورات في أبحاث سرطان المبيض من خلال استخدام خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. ومع ذلك ، هناك حاجة واضحة لنموذج أكثر تمثيلا وبأسعار معقولة في المختبر . أثبت?…
The authors have nothing to disclose.
نحن ممتنون لتوجيهات رون بوس ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ، ومساعدة باربرا بلاشوت ، دكتوراه في الطب ، في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج الباحث العلمي بجامعة واشنطن ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |