Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l’ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.
Gli organoidi sono modelli tumorali dinamici 3D che possono essere coltivati con successo da tessuto tumorale ovarico derivato dal paziente, ascite o liquido pleurico e aiutano nella scoperta di nuove terapie e biomarcatori predittivi per il cancro ovarico. Questi modelli ricapitolano l’eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Inoltre, hanno dimostrato di corrispondere al tumore primario morfologicamente, citologicamente, immunoistochimicamente e geneticamente. Pertanto, gli organoidi facilitano la ricerca sulle cellule tumorali e sul microambiente tumorale e sono superiori alle linee cellulari. Il presente protocollo descrive metodi distinti per generare organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente da tumori del paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. I campioni del paziente vengono separati in sospensioni cellulari mediante digestione meccanica ed enzimatica. Le cellule vengono quindi placcate utilizzando un estratto di membrana basale (BME) e sono supportate con terreni di crescita ottimizzati contenenti integratori specifici per la coltura del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC). Dopo aver formato gli organoidi iniziali, le DOP possono sostenere la cultura a lungo termine, incluso il passaggio per l’espansione per esperimenti successivi.
Nel 2021, circa 21.410 donne negli Stati Uniti sono state diagnosticate di recente con cancro ovarico epiteliale e 12.940 donne sono morte di questa malattia1. Sebbene siano stati fatti progressi sufficienti in chirurgia e chemioterapia, oltre il 70% dei pazienti con malattia avanzata sviluppa resistenza chemioterapica e muore entro 5 anni dalla diagnosi 2,3. Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove strategie per trattare questa malattia mortale e modelli rappresentativi e affidabili per la ricerca preclinica.
Le linee cellulari tumorali e gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) creati da tumori ovarici primari sono i principali strumenti utilizzati nella ricerca sul cancro ovarico. Uno dei principali vantaggi delle linee cellulari tumorali è la loro rapida espansione. Tuttavia, la loro coltura continua provoca alterazioni fenotipiche e genotipiche che causano le linee cellulari tumorali a deviare dal campione di tumore primario originale. A causa delle differenze esistenti tra la linea cellulare tumorale e il tumore primario, i test farmacologici che hanno effetti positivi nelle linee cellulari non riescono ad avere questi stessi effetti negli studi clinici2. Per superare queste limitazioni, vengono utilizzati i modelli PDX. Questi modelli sono creati impiantando tessuto fresco del cancro ovarico in topi immunodeficienti. Poiché sono modelli in vivo , assomigliano più accuratamente alle caratteristiche biologiche umane e, a loro volta, sono più predittivi dei risultati dei farmaci. Tuttavia, questi modelli hanno anche limitazioni significative, tra cui il costo, il tempo e le risorse necessarie per generarli4.
Le PDO offrono un modello alternativo per la ricerca preclinica che supera i limiti sia delle linee cellulari tumorali che dei modelli PDX. Le PDO ricapitolano il tumore e il microambiente tumorale di un paziente e, quindi, forniscono un modello trattabile in vitro ideale per la ricerca preclinica 2,3,5. Questi modelli 3D hanno capacità di auto-organizzazione che modellano il tumore primario, che è una caratteristica che le loro controparti bidimensionali (2D) della linea cellulare non possiedono. Inoltre, questi modelli hanno dimostrato di rappresentare geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e, quindi, sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici. In breve, offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine simili alle linee cellulari, ma comprendono anche il microambiente e le interazioni cellula-cellula inerenti ai modelli murini 4,6.
Il presente protocollo descrive la creazione di DOP da tumori derivati dal paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. Le colture DOP possono quindi essere espanse per più generazioni e utilizzate per testare la sensibilità alla terapia farmacologica e i biomarcatori predittivi. Questo metodo rappresenta una tecnica che potrebbe essere utilizzata per personalizzare i trattamenti in base alle risposte terapeutiche delle DOP.
Il cancro ovarico è estremamente mortale a causa del suo stadio avanzato alla diagnosi, così come lo sviluppo comune della resistenza alla chemioterapia. Molti progressi nella ricerca sul cancro ovarico sono stati fatti utilizzando linee cellulari tumorali e modelli PDX; Tuttavia, vi è un’evidente necessità di un modello in vitro più rappresentativo e conveniente. Le PDO hanno dimostrato di rappresentare accuratamente l’eterogeneità del tumore, il microambiente tumorale e le caratteristiche genomiche e tra…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati per la guida di Ron Bose, MD, PhD, e l’assistenza di Barbara Blachut, MD, nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche riconoscere la Scuola di Medicina della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean’s Scholar Program della Washington University e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |