Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen
Summary
Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.
Abstract
Organoide sind dynamische 3D-Tumormodelle, die erfolgreich aus patientischem Ovarialtumorgewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit gezüchtet werden können und bei der Entdeckung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker für Eierstockkrebs helfen. Diese Modelle rekapitulieren die klonale Heterogenität, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sie morphologisch, zytologisch, immunhistochemisch und genetisch mit dem Primärtumor übereinstimmen. So erleichtern Organoide die Erforschung von Tumorzellen und der Tumormikroumgebung und sind Zelllinien überlegen. Das vorliegende Protokoll beschreibt verschiedene Methoden zur Erzeugung von von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden aus Patiententumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die Patientenproben werden sowohl durch mechanischen als auch durch enzymatischen Aufschluss in zelluläre Suspensionen getrennt. Die Zellen werden dann mit einem Basalmembranextrakt (BME) plattiert und mit optimierten Wachstumsmedien unterstützt, die Nahrungsergänzungsmittel enthalten, die spezifisch für die Kultivierung von hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC) sind. Nach der Bildung der ersten Organoide können die PDOs eine Langzeitkultur aufrechterhalten, einschließlich der Passage zur Expansion für nachfolgende Experimente.
Introduction
Im Jahr 2021 wurde bei etwa 21.410 Frauen in den Vereinigten Staaten neu epithelialer Eierstockkrebs diagnostiziert, und 12.940 Frauen starben an dieser Krankheit1. Obwohl in der Chirurgie und Chemotherapie ausreichende Fortschritte erzielt wurden, entwickeln über 70% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eine chemotherapeutische Resistenz und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose 2,3. Neue Strategien zur Behandlung dieser tödlichen Krankheit und repräsentative, verlässliche Modelle für die präklinische Forschung sind daher dringend erforderlich.
Krebszelllinien und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die aus primären Ovarialtumoren hergestellt werden, sind die wichtigsten Instrumente, die in der Eierstockkrebsforschung verwendet werden. Ein großer Vorteil von Krebszelllinien ist ihre schnelle Expansion. Ihre kontinuierliche Kultur führt jedoch zu phänotypischen und genotypischen Veränderungen, die dazu führen, dass die Krebszelllinien von der ursprünglichen primären Krebstumorprobe abweichen. Aufgrund der bestehenden Unterschiede zwischen der Krebszelllinie und dem Primärtumor haben Arzneimittelassays, die positive Effekte in Zelllinien haben, inklinischen Studien nicht die gleichen Effekte 2. Um diese Einschränkungen zu überwinden, werden PDX-Modelle verwendet. Diese Modelle werden erstellt, indem frisches Eierstockkrebsgewebe in immundefiziente Mäuse implantiert wird. Da es sich um In-vivo-Modelle handelt, ähneln sie den biologischen Eigenschaften des Menschen genauer und sind wiederum prädiktiver für die Ergebnisse von Arzneimitteln. Diese Modelle weisen jedoch auch erhebliche Einschränkungen auf, einschließlich der Kosten, des Zeitaufwands und der Ressourcen, die für ihre Erstellung erforderlich sind4.
PDOs bieten ein alternatives Modell für die präklinische Forschung, das die Einschränkungen sowohl von Krebszelllinien als auch von PDX-Modellen überwindet. PDOs rekapitulieren den Tumor und die Tumormikroumgebung eines Patienten und bieten somit ein in vitro kontrollierbares Modell, das sich ideal für die präklinische Forschungeignet 2,3,5. Diese 3D-Modelle verfügen über Selbstorganisationsfähigkeiten, die den Primärtumor modellieren, was ein Merkmal ist, das ihre zweidimensionalen (2D) Zelllinien-Gegenstücke nicht besitzen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Modelle genetisch und funktionell ihre Muttertumoren repräsentieren und somit zuverlässige Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und biologischer Prozesse sind. Kurz gesagt, sie bieten langfristige Expansions- und Speicherfähigkeiten, die denen von Zelllinien ähneln, umfassen aber auch die Mikroumgebung und die Zell-Zell-Interaktionen, die Mausmodellen innewohnen 4,6.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erstellung von PDOs aus patienteneigenen Tumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die PDO-Kulturen können dann über mehrere Generationen erweitert und zum Testen der Sensitivität der medikamentösen Therapie und prädiktiver Biomarker verwendet werden. Diese Methode stellt eine Technik dar, die verwendet werden könnte, um Behandlungen basierend auf den therapeutischen Reaktionen von PDOs zu personalisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eierstockkrebs ist aufgrund seines fortgeschrittenen Stadiums bei der Diagnose sowie der häufigen Entwicklung einer Chemotherapieresistenz extrem tödlich. Viele Fortschritte in der Eierstockkrebsforschung wurden durch die Verwendung von Krebszelllinien und PDX-Modellen erzielt. Es besteht jedoch ein offensichtlicher Bedarf an einem repräsentativeren und erschwinglicheren In-vitro-Modell . PDOs repräsentieren nachweislich die Tumorheterogenität, die Tumormikroumgebung sowie die genomischen und transkriptomis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Anleitung von Ron Bose, MD, PhD, und die Unterstützung von Barbara Blachut, MD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean’s Scholar Program der Washington University und dem Reproductive Scientist Development Program für die Unterstützung dieses Projekts bedanken.
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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