Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme
Summary
Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.
Abstract
Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar, tümör yayılımının infiltratif doğası nedeniyle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Morfolojik olarak kompleks tümörlerdir ve hem tümörün kendisinde hem de heterojen mikro ortamında yüksek derecede proteomik değişkenlik gösterirler. Bu tümörlerin malign potansiyeli, hücresel stabiliteyi koruyan ve mikro çevrenin yapısal bütünlüğünü koruyan süreçler de dahil olmak üzere çeşitli anahtar yollarda yer alan proteinlerin düzensizliği ile arttırılmıştır. Çok sayıda toplu ve tek hücreli glioma analizi yapılmış olmasına rağmen, bu proteomik verilerin uzamsal tabakalaşmasında göreceli bir kıtlık vardır. İntrinsik tümör, invaziv kenar ve mikroçevre arasındaki tümörojenik faktörlerin ve immün hücre popülasyonlarının mekansal dağılımındaki farklılıkları anlamak, tümör proliferasyonu ve yayılımının altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Dijital uzamsal profil oluşturma (DSP), bu önemli çok katmanlı analizlerin temelini oluşturabilecek güçlü bir teknolojiyi temsil eder.
DSP, bir doku örneğinde kullanıcı tarafından belirlenen uzamsal bölgelerdeki protein ekspresyonunu verimli bir şekilde ölçen bir yöntemdir. DSP, birden fazla proteinin ayırt edici bölgeler içindeki ve arasındaki diferansiyel ekspresyonunu incelemek için idealdir ve çoklu seviyelerde nicel ve nitel analiz sağlar. DSP protokolü sistematik ve kullanıcı dostudur ve proteomik verilerin özelleştirilmiş uzamsal analizine izin verir. Bu deneyde, arşivlenmiş glioblastoma çekirdek biyopsilerinden doku mikrodizileri oluşturulmuştur. Daha sonra, numune içindeki ilgili proteinleri hedefleyen bir antikor paneli seçilir. UV-fotobölünebilir DNA oligonükleotidlerine önceden konjuge edilen antikorlar daha sonra bir gecede doku örneği ile inkübe edilir. Antikorların floresan mikroskopi görselleştirmesi altında, protein ekspresyonunun ölçüleceği ilgi alanları (ROI’ler) örneklerle tanımlanır. UV ışığı daha sonra DNA oligonükleotidlerini parçalayarak her ROI’ye yönlendirilir. Oligonükleotidler mikroaspire edilir ve her ROI içinde sayılır, karşılık gelen proteini mekansal olarak ölçer.
Introduction
Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar erişkinlerde en sık görülen malign beyin tümörü tipidir ve her zaman öldürücüdür. Glioma hücrelerinin beyinde yoğun bir şekilde göç etme eğilimi büyük bir terapötik zorluktur. Yayıldıkları mekanizma, yönlendirilmiş göç ve kontrolsüz istilayı içerir. İnvaziv glioma hücrelerinin beyaz cevher yolları boyunca tropizm ve migrasyon sergilediği gösterilmiştir1, son araştırmalar bu yolların aktif, protümörojenik bir özellik olarak demiyelinizasyonunu ima etmektedir2. İnvazyona, glioma hücrelerinin hücre dışı matriks proteinlerini ve hücre adezyon moleküllerini kodlayan genlerin ekspresyonunu azaltarak, göçü artırarak ve tümör mikroçevresi yoluyla yayılımı kolaylaştırarak mezenkimal özellikler kazandığı epitel-mezenkimal bir geçiş aracılık eder 3,4,5.
Moleküler düzeyde, hücresel stabilite sağlayan ve immünojenik bileşenlerle arayüz oluşturan çeşitli proteinlerin bozulması gösterilmiştir6. İnfiltratif gliomların, anti-apoptotik (örneğin, PTEN) özelliklere sahip proteinlerin baskılanmasına maruz kaldığı bilinmektedir7. Ayrıca, konakçı immün yanıtından kaçınmayı teşvik eden proteinleri aşırı eksprese ederler (örneğin, PD1 / PDL1)8. Bu kompleks yolakların düzensizliği tümörojenisiteyi arttırır ve malign potansiyeli arttırır.
İnvaziv glioma örneklerinde amaç, hücre büyümesi, sağkalım ve proliferasyon için anahtar proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu ve invaziv ve invaziv olmayan bileşenler arasındaki mikroçevre yapısal bütünlüğünü değerlendirmekti. Ek olarak, aktif immünojenik role sahip proteinlerin diferansiyel regülasyonunu incelemeye çalıştık ve tehlikeye giren konakçı immün savunmasının gliomların proliferatif ve invaziv potansiyelini artırabileceği mekanizmaya dair fikir vermeye çalıştık. Bu, özellikle malignitede immün belirteçlerin ve disregülasyon sürücülerinin immünoterapinin hedefleri olarak nasıl hizmet edebileceğini gösteren son araştırma genişliği göz önüne alındığında önemlidir. İmmünsüveyans ve reaktivitede rol oynayan birçok protein arasında uygulanabilir terapötik hedeflerin belirlenmesi, oldukça hassas ve kapsamlı bir yaklaşım gerektirir.
İncelenebilecek çok çeşitli aday proteinler göz önüne alındığında, immünohistokimyaya benzer, ancak gelişmiş veri işleme verimliliğine sahip bir yöntem aradık. Kanser biyolojisi alanında DSP, proteomik analiz ve niceleme için alternatif araçlara göre önemli avantajlara sahip güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. DSP’nin ayırt edici özelliği, bir numune içindeki birkaç farklı proteinin aynı anda incelenmesine izin veren ve immünohistokimya (IHC) 9,10 gibi standart ancak daha düşük pleks teknolojilerden önemli bir ayrım yapan yüksek verimli çoklama yeteneğidir. DSP’nin multipleks özelliği, DSP’yi IHC ile karşılaştıran çalışmaların gösterdiği gibi, nicel ve analitik bir araç olarak sadakatinden ödün vermez. Örneğin, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri örneklerinin proteomik nicelleştirilmesi için kullanıldığında, DSP’nin IHC11’e benzer sonuçlara sahip olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, DSP, kullanıcıların proteomik analiz gerçekleştirecekleri bölgeleri manuel olarak tanımlayabilecekleri özelleştirilebilir bölgesel spesifikasyonlar sunar. Bu, tüm kesitli çoklama yöntemlerine göre bir avantaj sunar10,12. DSP, tek bir işleme turunda, birden fazla ilgi alanındaki çeşitli protein hedeflerini inceleyerek birden fazla analiz katmanı sunar.
DSP’nin birkaç farklı patolojik ortamda uygulamaları vardır. DSP, onkolojik analizde özellikle avantajlıdır, çünkü uzamsal varyasyon hücresel transformasyon ve diferansiyel protein ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Örneğin, DSP, meme kanserinin proteomik profilini bitişik tümör mikro ortamıyla karşılaştırmak için kullanılmıştır. Bu, bu tümörün doğal geçmişini ve progresyonunu ve ayrıca tedaviye potansiyel yanıtı anlamak için önemli sonuçlar doğurur13. DSP’nin çok yönlülüğünü gösteren ek bağlamlar arasında prostat kanserinde protein çeşitliliğinin mekansal nicelleştirilmesi14, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomda immün hücre belirteci ekspresyonunun hastalık progresyonu ile ilişkisi 15 ve metastazı primer berrak hücreli yumurtalık kanserinden ayıran protein ekspresyonunun epitelyal-mezenkimal gradyanının gösterilmesi16 . DSP’yi uygulayarak, tümörigenezi ve gliomların invazyonunu etkileyebilecek proteinlerin mekansal topografyasını karakterize ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gliomların saldırganlığını potansiyel olarak etkileyebilecek proteinlerin çeşitliliği ve bu proteinlerin birçoğunun keşfedilmemiş olduğu fikri göz önüne alındığında, yüksek verimli bir protein nicelleştirme yöntemi ideal bir teknolojik yaklaşımdır. Ek olarak, onkolojik örneklerdeki uzamsal verilerin genellikle diferansiyel ekspresyon18 ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, mekansal profillemenin protein nicelleştirme yaklaşımına dahil edilmesi daha etk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Dartmouth Hitchcock Sağlık Sistemi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü’ndeki Klinik Genomik ve İleri Teknoloji Laboratuvarı’nın desteğini kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca NCI Kanser Merkezi Destek Hibe 5P30 CA023108-37 ile Dartmouth Kanser Merkezi’ndeki Patoloji Paylaşılan Kaynağını da kabul etmektedir.
Materials
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -. T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii, , et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
