La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L’elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l’espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all’invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.
I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l’integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c’è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.
DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l’espressione proteica all’interno di regioni spaziali specificate dall’utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l’espressione differenziale di più proteine all’interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un’analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all’interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all’interno delle quali quantificare l’espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all’interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.
I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l’invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca1, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva2. L’invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesenchimale, in cui le cellule di glioma acquisiscono proprietà mesenchimali riducendo l’espressione di geni codificanti proteine della matrice extracellulare e molecole di adesione cellulare, amplificando la migrazione e facilitando la propagazione attraverso il microambiente tumorale 3,4,5.
A livello molecolare, è stata dimostrata la rottura di diverse proteine che conferiscono stabilità cellulare e interfaccia con componenti immunogenici6. È noto che i gliomi infiltrativi subiscono la soppressione di proteine con proprietà anti-apoptotiche (ad esempio, PTEN)7. Inoltre sovraesprimono proteine che promuovono l’evasione della risposta immunitaria dell’ospite (ad esempio, PD1 / PDL1)8. La disregolazione di queste vie complesse aumenta la tumorigenicità e aumenta il potenziale maligno.
All’interno di campioni di glioma invasivo, l’obiettivo era quello di valutare l’espressione differenziale di proteine chiave per la crescita, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare e per l’integrità strutturale del microambiente tra componenti invasive e non invasive. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la regolazione differenziale delle proteine con un ruolo immunogenico attivo, offrendo informazioni sul meccanismo attraverso il quale le difese immunitarie dell’ospite compromesso possono aumentare il potenziale proliferativo e invasivo dei gliomi. Ciò è particolarmente rilevante data la recente ampiezza della ricerca che dimostra come i marcatori immunitari e i driver della disregolazione nella malignità possano servire come bersagli dell’immunoterapia. L’identificazione di bersagli terapeutici praticabili tra le molte proteine coinvolte nell’immunosorveglianza e nella reattività richiede un approccio altamente sensibile e completo.
Data l’ampia gamma di proteine candidate che possono essere studiate, abbiamo cercato un metodo simile all’immunoistochimica ma con una maggiore efficienza di elaborazione dei dati. Nel campo della biologia del cancro, DSP è emersa come una potente tecnologia con importanti vantaggi rispetto agli strumenti alternativi per l’analisi proteomica e la quantificazione. Il segno distintivo del DSP è la sua capacità di multiplexing ad alto rendimento, che consente lo studio simultaneo di diverse proteine all’interno di un campione, segnando un’importante distinzione dalle tecnologie standard ma a basso plex come l’immunoistochimica (IHC)9,10. La caratteristica multiplex del DSP non ne compromette la fedeltà come strumento quantitativo e analitico, come dimostrato da studi che confrontano DSP e IHC. Quando viene utilizzato per la quantificazione proteomica di campioni di carcinoma polmonare non a piccole cellule, ad esempio, DSP ha dimostrato di avere risultati simili a IHC11. Inoltre, DSP offre specifiche regionali personalizzabili, in cui gli utenti possono definire manualmente le regioni all’interno delle quali eseguire l’analisi proteomica. Ciò presenta un vantaggio rispetto ai metodi multiplex a sezione intera10,12. In un unico ciclo di elaborazione, DSP offre quindi più livelli di analisi esaminando diversi bersagli proteici in più regioni di interesse.
DSP ha applicazioni in diversi contesti patologici. La DSP è particolarmente vantaggiosa nell’analisi oncologica, poiché la variazione spaziale può essere correlata alla trasformazione cellulare e all’espressione differenziale delle proteine. Ad esempio, DSP è stato utilizzato per confrontare il profilo proteomico del cancro al seno con il microambiente tumorale adiacente. Ciò comporta importanti implicazioni per la comprensione della storia naturale di questo tumore e della sua progressione, nonché della potenziale risposta al trattamento13. Ulteriori contesti che illustrano la versatilità della DSP includono la quantificazione spaziale della diversità proteica nel carcinoma prostatico14, l’associazione dell’espressione dei marcatori delle cellule immunitarie con la progressione della malattia nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo 15 e la dimostrazione di un gradiente epiteliale-mesenchimale dell’espressione proteica che distingue il carcinoma ovarico metastatico da quello primario a cellule chiare16 . Implementando la DSP, caratterizziamo la topografia spaziale delle proteine che potrebbero influenzare la tumorigenesi e l’invasione dei gliomi.
Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l’aggressività dei gliomi e l’idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l’espressione differenziale18, incorporare la profilazione spaziale nell’approccio di quantificazione delle proteine consente un’analisi più efficace.
…The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono il supporto del Laboratorio di genomica clinica e tecnologia avanzata nel Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio del Dartmouth Hitchcock Health System. Gli autori riconoscono anche la risorsa condivisa di patologia presso il Dartmouth Cancer Center con NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |