成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング
Summary
プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。
Abstract
びまん性浸潤性神経膠腫は、腫瘍転移の浸潤性の性質のために、高い罹患率および死亡率と関連している。それらは形態学的に複雑な腫瘍であり、腫瘍自体とその不均一な微小環境の両方にわたって高度なプロテオミクス変動性を有する。これらの腫瘍の悪性化の可能性は、細胞の安定性を維持し、微小環境の構造的完全性を維持するプロセスを含む、いくつかの重要な経路に関与するタンパク質の調節不全によって増強されます。バルクおよび単一細胞神経膠腫の解析は数多く行われていますが、これらのプロテオミクスデータの空間層別化は比較的不足しています。内因性腫瘍、浸潤端、微小環境の間の腫瘍形成因子と免疫細胞集団の空間分布の違いを理解することは、腫瘍の増殖と伝播の根底にあるメカニズムへの貴重な洞察を提供します。デジタル空間プロファイリング(DSP)は、これらの重要な多層解析の基盤を形成できる強力なテクノロジーです。
DSPは、組織標本中のユーザー指定の空間領域内のタンパク質発現を効率的に定量化する方法です。DSPは、区別領域内および領域間での複数のタンパク質の発現差を研究するのに理想的であり、複数のレベルの定量的および定性的分析を可能にします。DSPプロトコルは体系的でユーザーフレンドリーであり、プロテオミクスデータのカスタマイズされた空間分析を可能にします。この実験では、組織マイクロアレイは、アーカイブされた膠芽腫コア生検から構築されます。次に、サンプル内の目的のタンパク質を標的とする抗体のパネルが選択されます。次に、UV光切断可能なDNAオリゴヌクレオチドにプレコンジュゲートされた抗体を組織サンプルとともに一晩インキュベートします。抗体の蛍光顕微鏡による可視化下で、タンパク質発現を定量するための関心領域(ROI)がサンプルとともに定義されます。次に、UV光が各ROIに向けられ、DNAオリゴヌクレオチドが切断されます。オリゴヌクレオチドはマイクロ吸引され、各ROI内でカウントされ、対応するタンパク質を空間ベースで定量します。
Introduction
びまん性浸潤性神経膠腫は、成人の悪性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、常に致命的です。神経膠腫細胞が脳内で広範囲に移動する傾向は、主要な治療上の課題です。それらが広がるメカニズムには、指示された移動とチェックされていない侵入が含まれます。浸潤性グリオーマ細胞は、白質路に沿った向性と遊走を示すことが示されており1、最近の研究では、これらの管の脱髄が活性で腫瘍形成性の特徴として関与しています2。浸潤は上皮から間葉への移行によって媒介され、グリオーマ細胞は、細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着分子をコードする遺伝子の発現を低下させ、遊走を増幅し、腫瘍微小環境を介した増殖を促進することによって間葉系特性を獲得する3,4,5。
分子レベルでは、細胞の安定性と免疫原性成分との界面を付与するいくつかのタンパク質の破壊が実証されています6。浸潤性神経膠腫は、抗アポトーシス性(PTENなど)特性を有するタンパク質の抑制を受けることが知られている7。また、宿主の免疫応答の回避を促進するタンパク質(PD1/PDL1など)を過剰発現しています8。これらの複雑な経路の調節不全は、腫瘍形成性を高め、悪性の可能性を高めます。
浸潤性神経膠腫のサンプル内で、目的は、細胞の成長、生存、増殖、および侵襲性成分と非侵襲性成分の間の微小環境構造的完全性に鍵となるタンパク質の発現差を評価することでした。さらに、能動的免疫原性の役割を持つタンパク質の異なる制御を研究し、宿主の免疫防御の損なわれが神経膠腫の増殖性および侵襲性の可能性を高めるメカニズムへの洞察を提供しようとしました。これは、悪性腫瘍の免疫マーカーと調節不全のドライバーが免疫療法の標的としてどのように役立つかを示す最近の幅広い研究を考えると、特に重要です。免疫監視と反応性に関与する多くのタンパク質の中から実行可能な治療標的を特定するには、高感度で包括的なアプローチが必要です。
研究可能な候補タンパク質が多岐にわたることから、免疫組織化学に類似し、データ処理効率を高めた方法を探しました。がん生物学の分野では、DSPはプロテオミクス解析と定量のための代替ツールよりも重要な利点を持つ強力な技術として浮上しています。DSPの特徴は、サンプル内の複数の異なるタンパク質を同時に研究できるハイスループットマルチプレックス機能であり、免疫組織化学(IHC)9,10などの標準的ではあるが低プレックス技術との重要な違いを示しています。DSPのマルチプレックス機能は、DSPとIHCを比較した研究で示されているように、定量的および分析ツールとしての忠実度を損なうことはありません。非小細胞肺癌標本のプロテオミクス定量に用いた場合、例えば、DSPはIHC11と同様の結果を有することが示されている。さらに、DSPはカスタマイズ可能な地域仕様を提供し、ユーザーはプロテオーム解析を実行する領域を手動で定義できます。これは、全セクション多重化方式10、12よりも有利である。したがって、DSPは、1回の処理で、複数の関心領域にわたる複数のタンパク質ターゲットを調査することにより、複数の分析層を提供します。
DSPは、いくつかの異なる病理学的設定でアプリケーションを持っています。DSPは、空間的変動が細胞形質転換および異なるタンパク質発現と相関する可能性があるため、腫瘍学的分析において特に有利です。例えば、DSPは、乳癌のプロテオミクスプロファイルを隣接する腫瘍微小環境と比較するために使用されている。これは、この腫瘍とその進行の自然史、および治療に対する潜在的な反応を理解する上で重要な意味を持ちます13。DSPの多様性を示す追加のコンテキストには、前立腺癌におけるタンパク質多様性の空間的定量化14、頭頸部扁平上皮癌における免疫細胞マーカー発現と疾患進行との関連15、および原発性明細胞卵巣癌から転移性を区別するタンパク質発現の上皮間葉系勾配の実証が含まれます16.DSPを実装することにより、腫瘍形成と神経膠腫の浸潤に影響を与える可能性のあるタンパク質の空間的トポグラフィーを特徴付けます。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経膠腫の攻撃性に影響を与える可能性のあるタンパク質の多様性と、これらのタンパク質のいくつかが未発見のままであるという考えを考えると、ハイスループットタンパク質定量法は理想的な技術的アプローチです。さらに、腫瘍学的サンプル中の空間データは示差的発現18と相関することが多いため、空間プロファイリングをタンパク質定量アプローチに組み込むこ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ダートマスヒッチコックヘルスシステムの病理学および検査医学部門の臨床ゲノミクスおよび先端技術研究所の支援を認めています。著者らはまた、ダートマスがんセンターの病理学共有リソースとNCIがんセンターサポート助成金5P30 CA023108-37を認めています。
Materials
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
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