דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.
גליומות מסתננות באופן מפוזר קשורות לתחלואה ותמותה גבוהות בשל האופי המסתנן של התפשטות הגידול. הם גידולים מורכבים מבחינה מורפולוגית, עם רמה גבוהה של שונות פרוטאומית הן על פני הגידול עצמו והן על פני המיקרו-סביבה ההטרוגנית שלו. הפוטנציאל הממאיר של גידולים אלה מועצם על ידי דיסרגולציה של חלבונים המעורבים במספר מסלולים מרכזיים, כולל תהליכים השומרים על יציבות התאים ושומרים על השלמות המבנית של המיקרו-סביבה. אף על פי שהיו מספר רב של ניתוחי גליומה בתפזורת וחד-תאית, יש מיעוט יחסי של ריבוד מרחבי של נתונים פרוטאומיים אלה. הבנת ההבדלים בהתפלגות המרחבית של גורמי הגידול ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין הגידול הפנימי, הקצה הפולשני והמיקרו-סביבה מציעה תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים העומדים בבסיס התפשטות והתפשטות הגידול. פרופיל מרחבי דיגיטלי (DSP) מייצג טכנולוגיה רבת-עוצמה שיכולה להוות את הבסיס לניתוחים רב-שכבתיים חשובים אלה.
DSP היא שיטה המכמתת ביעילות ביטוי חלבונים בתוך אזורים מרחביים שצוינו על ידי המשתמש בדגימת רקמה. DSP אידיאלי לחקר הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מרובים בתוך ובין אזורי הבחנה, ומאפשר רמות מרובות של ניתוח כמותי ואיכותי. פרוטוקול DSP הוא שיטתי וידידותי למשתמש, ומאפשר ניתוח מרחבי מותאם אישית של נתונים פרוטאומיים. בניסוי זה, מיקרו-מערכים של רקמות בנויים מביופסיות ליבה של גליובלסטומה בארכיון. לאחר מכן, נבחר פאנל של נוגדנים, המכוונים לחלבונים בעלי עניין בתוך הדגימה. הנוגדנים, אשר מצומדים מראש לאוליגונוקלאוטידים של דנ”א הניתנים לפוטו-קלאוטידים, מודגרים לאחר מכן עם דגימת הרקמה למשך הלילה. תחת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של הנוגדנים, אזורי עניין (ROIs) שבתוכם ניתן לכמת את ביטוי החלבון מוגדרים עם הדגימות. לאחר מכן, אור UV מופנה לכל החזר על ההשקעה, ומבקע את האוליגונוקלאוטידים של הדנ”א. האוליגונוקלאוטידים עוברים מיקרו-אספירציה ונספרים בתוך כל החזר השקעה, מה שמכמת את החלבון המתאים על בסיס מרחבי.
גליומות מסתננות מפוזרות הן הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוח ממאיר במבוגרים והן תמיד קטלניות. הנטייה של תאי גליומה לנדוד באופן נרחב במוח היא אתגר טיפולי גדול. המנגנון שבאמצעותו הם מתפשטים כרוך בהגירה מכוונת ובפלישה לא מבוקרת. תאי גליומה פולשניים הוכחו כמפגינים טרופיזם והגירה לאורך דרכי החומר הלבן1, כאשר מחקרים אחרונים מצביעים על דה-מיאלינציה של דרכי אלה כתכונה פעילה ופרוטומוריגנית2. הפלישה מתווכת על ידי מעבר אפיתליאלי למזנכימלי, שבו תאי גליומה רוכשים תכונות מזנכימליות על ידי הפחתת הביטוי של גנים המקודדים חלבוני מטריצה חוץ-תאית ומולקולות הידבקות תאים, הגברת הנדידה והקלה על התפשטות דרך המיקרו-סביבה של הגידול 3,4,5.
ברמה המולקולרית, הודגם שיבוש של מספר חלבונים המעניקים יציבות תאית וממשק עם רכיבים אימונוגניים6. גליומות מסתננות ידועות כעוברות דיכוי של חלבונים בעלי תכונות אנטי-אפופטוטיות (למשל, PTEN)7. הם גם מבטאים יתר על המידה חלבונים המקדמים התחמקות מהתגובה החיסונית של המארח (למשל, PD1/PDL1)8. הדיסרגולציה של מסלולים מורכבים אלה משפרת את הגידוליות ומגדילה את הפוטנציאל הממאיר.
בדגימות של גליומה פולשנית, המטרה הייתה להעריך את הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים המפתח לגדילה, הישרדות ושגשוג של תאים, ולשלמות מבנית של מיקרו-סביבה בין מרכיבים פולשניים ולא פולשניים. בנוסף, ביקשנו לחקור את הוויסות הדיפרנציאלי של חלבונים בעלי תפקיד אימונוגני פעיל, ולהציע תובנה לגבי המנגנון שבאמצעותו הגנות חיסוניות של פונדקאי שנפגעות עשויות להגביר את הפוטנציאל השגשוג והפולשני של גליומות. זה רלוונטי במיוחד בהתחשב ברוחב המחקרים האחרונים המדגימים כיצד סמנים חיסוניים ומניעים של חוסר ויסות בממאירות יכולים לשמש כמטרות של אימונותרפיה. זיהוי מטרות טיפוליות ברות קיימא מבין החלבונים הרבים המעורבים במעקב חיסוני ובתגובתיות דורש גישה רגישה ומקיפה ביותר.
בהתחשב במגוון הרחב של חלבונים מועמדים שניתן לחקור, חיפשנו שיטה הדומה לאימונוהיסטוכימיה אך עם יעילות עיבוד נתונים משופרת. בתחום הביולוגיה של הסרטן, DSP התפתחה כטכנולוגיה רבת עוצמה עם יתרונות חשובים על פני כלים חלופיים לניתוח וכימות פרוטאומי. סימן ההיכר של DSP הוא יכולת הריבוב שלו בתפוקה גבוהה, המאפשרת מחקר סימולטני של מספר חלבונים שונים בתוך דגימה, מה שמסמן הבדל חשוב מטכנולוגיות סטנדרטיות אך בעלות פלקס נמוך יותר כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC)9,10. תכונת המולטיפלקס של DSP אינה פוגעת בנאמנותו ככלי כמותי ואנליטי, כפי שמודגם על ידי מחקרים המשווים את DSP ל- IHC. כאשר משתמשים בו לכימות פרוטאומי של דגימות סרטן ריאה של תאים לא קטנים, למשל, הוכח כי DSP משיג תוצאות דומות ל-IHC11. בנוסף, DSP מציעה מפרט אזורי הניתן להתאמה אישית, שבו משתמשים יכולים להגדיר באופן ידני אזורים שבתוכם ניתן לבצע ניתוח פרוטאומי. זה מציג יתרון על פני שיטות מולטיפלקס של מקטע שלם10,12. בסבב אחד של עיבוד, DSP מציעה אפוא שכבות מרובות של ניתוח על ידי סקר מספר מטרות חלבון על פני אזורי עניין מרובים.
DSP יש יישומים במספר הגדרות פתולוגיות שונות. DSP הוא יתרון במיוחד בניתוח אונקולוגי, שכן שונות מרחבית יכולה להיות בקורלציה עם טרנספורמציה תאית וביטוי חלבונים דיפרנציאליים. לדוגמה, DSP שימש להשוואת הפרופיל הפרוטאומי של סרטן השד למיקרו-סביבה של הגידול הסמוך. לכך השלכות חשובות על הבנת ההיסטוריה הטבעית של גידול זה והתקדמותו, כמו גם על התגובה הפוטנציאלית לטיפול13. הקשרים נוספים הממחישים את הרבגוניות של DSP כוללים כימות מרחבי של מגוון החלבונים בסרטן הערמונית14, קשר של ביטוי סמן תאי חיסון עם התקדמות המחלה בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר15, והדגמה של שיפוע אפיתל-מזנכימלי של ביטוי חלבונים המבחין בין סרטן שחלות גרורתי לסרטן שחלות ראשוני צלול16 . על ידי יישום DSP, אנו מאפיינים את הטופוגרפיה המרחבית של חלבונים שיכולים להשפיע על גידולים ופלישה של גליומות.
בהתחשב במגוון החלבונים שעשויים להשפיע על האגרסיביות של גליומות והרעיון שכמה מהחלבונים האלה עדיין לא התגלו, שיטת כימות חלבונים בתפוקה גבוהה היא גישה טכנולוגית אידיאלית. בנוסף, בהתחשב בכך שנתונים מרחביים בדגימות אונקולוגיות מתואמים לעתים קרובות עם ביטוי דיפרנציאלי18, שילוב פ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים על תמיכת המעבדה לגנומיקה קלינית וטכנולוגיה מתקדמת במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית של מערכת הבריאות של דארטמות’ היצ’קוק. המחברים גם מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה במרכז הסרטן של דארטמות’ עם מענק תמיכה של מרכז הסרטן של NCI 5P30 CA023108-37.
BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |