Цифровое пространственное профилирование для характеристики микросреды при диффузно проникающей глиоме взрослого типа

Summary

Протеомная дисрегуляция играет важную роль в распространении диффузно инфильтрирующих глиом, но несколько соответствующих белков остаются неидентифицированными. Цифровая пространственная обработка (DSP) предлагает эффективный, высокопроизводительный подход для характеристики дифференциальной экспрессии белков-кандидатов, которые могут способствовать инвазии и миграции инфильтративных глиом.

Abstract

Диффузно инфильтрирующие глиомы связаны с высокой заболеваемостью и смертностью из-за инфильтративного характера распространения опухоли. Они представляют собой морфологически сложные опухоли с высокой степенью протеомной изменчивости как в самой опухоли, так и в ее гетерогенном микроокружении. Злокачественный потенциал этих опухолей усиливается дисрегуляцией белков, участвующих в нескольких ключевых путях, включая процессы, которые поддерживают клеточную стабильность и сохраняют структурную целостность микросреды. Хотя было проведено множество объемных и одноклеточных анализов глиомы, существует относительная нехватка пространственной стратификации этих протеомных данных. Понимание различий в пространственном распределении опухолевых факторов и популяций иммунных клеток между внутренней опухолью, инвазивным краем и микроокружением дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе пролиферации и распространения опухоли. Цифровое пространственное профилирование (DSP) представляет собой мощную технологию, которая может стать основой для этих важных многослойных анализов.

DSP – это метод, который эффективно количественно определяет экспрессию белка в заданных пользователем пространственных областях в образце ткани. DSP идеально подходит для изучения дифференциальной экспрессии нескольких белков внутри и между регионами различия, обеспечивая несколько уровней количественного и качественного анализа. Протокол DSP является систематическим и удобным для пользователя, что позволяет проводить индивидуальный пространственный анализ протеомных данных. В этом эксперименте тканевые микрочипы строятся из архивных биопсий ядра глиобластомы. Затем выбирается панель антител, нацеленных на интересующие белки в образце. Антитела, которые предварительно конъюгируются с Олигонуклеотидами УФ-фоторасщепления ДНК, затем инкубируются с образцом ткани в течение ночи. При флуоресцентной микроскопии визуализации антител с образцами определяются области интереса (ROI), в пределах которых можно количественно оценить экспрессию белка. Затем ультрафиолетовый свет направляется на каждый ROI, расщепляя ДНК олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды микроаспирируются и подсчитываются в пределах каждого ROI, количественно оценивая соответствующий белок на пространственной основе.

Introduction

Диффузно инфильтрирующие глиомы являются наиболее распространенным типом злокачественной опухоли головного мозга у взрослых и неизменно летальны. Склонность клеток глиомы к обширной миграции в мозге является серьезной терапевтической проблемой. Механизм, с помощью которого они распространяются, включает в себя направленную миграцию и неконтролируемое вторжение. Было показано, что инвазивные клетки глиомы демонстрируют тропизм и миграцию вдоль трактов белого вещества¹, причем недавние исследования предполагают демиелинизацию этих путей в качестве активного протуморигенного признака². Инвазия опосредована эпителиально-мезенхимальным переходом, при котором клетки глиомы приобретают мезенхимальные свойства за счет снижения экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул клеточной адгезии, усиливая миграцию и облегчая распространение через микроокружение опухоли ^3,4,5.

На молекулярном уровне было продемонстрировано нарушение работы нескольких белков, которые придают клеточную стабильность и взаимодействие с иммуногенными компонентами⁶. Инфильтративные глиомы, как известно, подвергаются подавлению белков с антиапоптотическими (например, PTEN) свойствами⁷. Они также сверхэкспрессируют белки, которые способствуют уклонению иммунного ответа хозяина (например, PD1 / PDL1)⁸. Дисрегуляция этих сложных путей усиливает опухолегенность и повышает злокачественный потенциал.

В образцах инвазивной глиомы цель состояла в том, чтобы оценить дифференциальную экспрессию белков, имеющих ключевое значение для роста, выживания и пролиферации клеток, а также для структурной целостности микросреды между инвазивными и неинвазивными компонентами. Кроме того, мы стремились изучить дифференциальную регуляцию белков с активной иммуногенной ролью, предлагая понимание механизма, с помощью которого скомпрометированная иммунная защита хозяина может усиливать пролиферативный и инвазивный потенциал глиом. Это особенно актуально, учитывая недавнюю широту исследований, демонстрирующих, как иммунные маркеры и драйверы дисрегуляции злокачественных новообразований могут служить мишенями иммунотерапии. Определение жизнеспособных терапевтических мишеней среди многих белков, участвующих в иммунонадзоре и реактивности, требует высокочувствительного и комплексного подхода.

Учитывая широкий спектр белков-кандидатов, которые могут быть изучены, мы искали метод, похожий на иммуногистохимию, но с повышенной эффективностью обработки данных. В области биологии рака DSP стала мощной технологией с важными преимуществами по сравнению с альтернативными инструментами для протеомного анализа и количественной оценки. Отличительной чертой DSP является его высокопроизводительная мультиплексирующая способность, позволяющая одновременно изучать несколько различных белков в образце, отмечая важное отличие от стандартных, но низкоплексных технологий, таких как иммуногистохимия (IHC)^9,10. Мультиплексная особенность DSP не ставит под угрозу его точность как количественного и аналитического инструмента, как показали исследования, сравнивающие DSP с IHC. При использовании для протеомной количественной оценки образцов немелкоклеточного рака легкого, например, было показано, что DSP имеет результаты, аналогичные IHC¹¹. Кроме того, DSP предлагает настраиваемую региональную спецификацию, в которой пользователи могут вручную определять области, в которых выполняется протеомный анализ. Это представляет собой преимущество перед методами мультиплексирования всего сечения^10,12. Таким образом, в одном раунде обработки DSP предлагает несколько уровней анализа, исследуя несколько белковых мишеней в нескольких областях, представляющих интерес.

DSP имеет применение в нескольких различных патологических условиях. DSP особенно выгоден в онкологическом анализе, так как пространственная изменчивость может коррелировать с клеточной трансформацией и дифференциальной экспрессией белка. Например, DSP был использован для сравнения протеомного профиля рака молочной железы с соседним микроокружением опухоли. Это имеет важные последствия для понимания естественной истории этой опухоли и ее прогрессирования, а также потенциального ответа на лечение¹³. Дополнительные контексты, иллюстрирующие универсальность DSP, включают пространственную количественную оценку разнообразия белков при раке предстательной железы¹⁴, связь экспрессии маркера иммунных клеток с прогрессированием заболевания при плоскоклеточном раке головы и шеи¹⁵ и демонстрацию эпителиально-мезенхимального градиента экспрессии белка, отличающего метастатический рак яичников от первичного чистоклеточного рака яичников¹⁶ . Реализуя DSP, мы характеризуем пространственную топографию белков, которые могут влиять на опухолевыйгенез и инвазию глиом.

Protocol

Протокол, изложенный ниже, соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человека Дартмута-Хичкока. Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы тканей были включены в это исследование. В разделе Таблица материалов приведены подробные</str…

Representative Results

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты эксперимента DSP, проведенного на образцах глиобластомы. Представлена тепловая карта, иллюстрирующая один из методов визуального сбора данных с помощью программного обеспечения DSP. Строки представляют белковые мишени, ?…

Discussion

Учитывая разнообразие белков, которые потенциально могут влиять на агрессивность глиом, и представление о том, что некоторые из этих белков остаются неоткрытыми, высокопроизводительный метод количественной оценки белка является идеальным технологическим подходом. Кроме того, учитыв…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block