التنميط المكاني الرقمي لتوصيف البيئة المكروية في الورم الدبقي المتسلل بشكل منتشر من النوع البالغ
Summary
يلعب خلل التنظيم البروتيني دورا مهما في انتشار الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر ، لكن العديد من البروتينات ذات الصلة لا تزال مجهولة الهوية. توفر المعالجة المكانية الرقمية (DSP) نهجا فعالا وعالي الإنتاجية لتوصيف التعبير التفاضلي للبروتينات المرشحة التي قد تساهم في غزو وهجرة الأورام الدبقية الارتشاحية.
Abstract
ترتبط الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر بارتفاع معدلات المراضة والوفيات بسبب الطبيعة الارتشاحية لانتشار الورم. إنها أورام معقدة شكليا ، مع درجة عالية من التباين البروتيني عبر كل من الورم نفسه وبيئته المكروية غير المتجانسة. يتم تعزيز الإمكانات الخبيثة لهذه الأورام من خلال عدم تنظيم البروتينات المشاركة في العديد من المسارات الرئيسية ، بما في ذلك العمليات التي تحافظ على الاستقرار الخلوي وتحافظ على السلامة الهيكلية للبيئة المكروية. على الرغم من وجود العديد من تحليلات الورم الدبقي السائب وحيد الخلية ، إلا أن هناك ندرة نسبية في التقسيم الطبقي المكاني لهذه البيانات البروتينية. إن فهم الاختلافات في التوزيع المكاني للعوامل السرطانية ومجموعات الخلايا المناعية بين الورم الجوهري والحافة الغازية والبيئة المكروية يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الكامنة وراء تكاثر الورم وانتشاره. يمثل التنميط المكاني الرقمي (DSP) تقنية قوية يمكن أن تشكل الأساس لهذه التحليلات المهمة متعددة الطبقات.
DSP هي طريقة تحدد بكفاءة تعبير البروتين داخل المناطق المكانية المحددة من قبل المستخدم في عينة الأنسجة. يعد DSP مثاليا لدراسة التعبير التفاضلي للبروتينات المتعددة داخل وعبر مناطق التمييز ، مما يتيح مستويات متعددة من التحليل الكمي والنوعي. بروتوكول DSP منهجي وسهل الاستخدام ، مما يسمح بالتحليل المكاني المخصص للبيانات البروتينية. في هذه التجربة ، يتم إنشاء المصفوفات الدقيقة للأنسجة من الخزعات الأساسية للورم الأرومي الدبقي المؤرشفة. بعد ذلك ، يتم اختيار مجموعة من الأجسام المضادة ، تستهدف البروتينات ذات الأهمية داخل العينة. ثم يتم تحضين الأجسام المضادة ، التي يتم اقترانها مسبقا بقليل النيوكليوتيدات DNA القابل للأشعة فوق البنفسجية ، مع عينة الأنسجة طوال الليل. تحت التصور المجهري الفلوري للأجسام المضادة ، يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) التي يمكن من خلالها تحديد تعبير البروتين مع العينات. ثم يتم توجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى كل عائد استثمار ، مما يؤدي إلى شق قليل النيوكليوتيدات DNA. يتم استنشاق قليل النوكليوتيدات وحسابها داخل كل عائد استثمار ، مع تحديد البروتين المقابل على أساس مكاني.
Introduction
الأورام الدبقية المتسللة بشكل منتشر هي النوع الأكثر شيوعا من أورام الدماغ الخبيثة لدى البالغين وهي قاتلة دائما. يمثل ميل خلايا الورم الدبقي إلى الهجرة على نطاق واسع في الدماغ تحديا علاجيا كبيرا. وتنطوي الآلية التي تنتشر بها على الهجرة الموجهة والغزو دون رادع. وقد تبين أن خلايا الورم الدبقي الغازية تظهر الانتحاء والهجرة على طول مساحات المادة البيضاء1 ، مع الأبحاث الحديثة التي تنطوي على إزالة الميالين من هذه المسالك كميزة نشطة ، protumorigenic2. يتم التوسط في الغزو من خلال الانتقال من الظهارة إلى اللحمة المتوسطة ، حيث تكتسب خلايا الورم الدبقي خصائص اللحمة المتوسطة عن طريق تقليل التعبير عن الجينات التي تشفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية وجزيئات التصاق الخلايا ، وتضخيم الهجرة وتسهيل الانتشار من خلال البيئة المكروية للورم3،4،5.
على المستوى الجزيئي ، تم إثبات اضطراب العديد من البروتينات التي تمنح الاستقرار الخلوي والتفاعل مع المكونات المناعية6. من المعروف أن الأورام الدبقية الارتشاحية تخضع لقمع البروتينات ذات الخصائص المضادة للموت المبرمج (على سبيل المثال ، PTEN)7. كما أنها تفرط في التعبير عن البروتينات التي تعزز التهرب من الاستجابة المناعية للمضيف (على سبيل المثال ، PD1 / PDL1)8. يعزز عدم تنظيم هذه المسارات المعقدة الورم ويزيد من الإمكانات الخبيثة.
ضمن عينات الورم الدبقي الغازي ، كان الهدف هو تقييم التعبير التفاضلي للبروتينات الرئيسية لنمو الخلايا وبقائها وانتشارها ، والتكامل الهيكلي للبيئة المكروية بين المكونات الغازية وغير الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، سعينا إلى دراسة التنظيم التفاضلي للبروتينات ذات الدور المناعي النشط ، وتقديم نظرة ثاقبة للآلية التي يمكن من خلالها للدفاعات المناعية للمضيف المخترقة أن تعزز الإمكانات التكاثرية والغازية للأورام الدبقية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى اتساع نطاق الأبحاث الحديثة التي توضح كيف يمكن أن تكون علامات المناعة ودوافع عدم التنظيم في الورم الخبيث بمثابة أهداف للعلاج المناعي. يتطلب تحديد الأهداف العلاجية القابلة للتطبيق بين العديد من البروتينات المشاركة في المراقبة المناعية والتفاعل نهجا حساسا وشاملا للغاية.
بالنظر إلى المجموعة الواسعة من البروتينات المرشحة التي يمكن دراستها ، سعينا إلى طريقة أقرب إلى الكيمياء الهيستولوجية المناعية ولكن مع كفاءة معالجة البيانات المحسنة. في مجال بيولوجيا السرطان ، برزت DSP كتقنية قوية ذات مزايا مهمة على الأدوات البديلة للتحليل البروتيني والقياس الكمي. السمة المميزة ل DSP هي قدرتها على تعدد الإرسال عالية الإنتاجية ، مما يسمح بالدراسة المتزامنة للعديد من البروتينات المختلفة داخل العينة ، مما يمثل تمييزا مهما عن التقنيات القياسية ولكن الأقل تكرارا مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) 9,10. لا تؤثر ميزة تعدد الإرسال في DSP على دقتها كأداة كمية وتحليلية ، كما يتضح من الدراسات التي تقارن DSP ب IHC. عند استخدامه للقياس الكمي البروتيني لعينات سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة ، على سبيل المثال ، فقد ثبت أن DSP له نتائج مماثلة ل IHC11. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر DSP مواصفات إقليمية قابلة للتخصيص ، حيث يمكن للمستخدمين تحديد المناطق يدويا لإجراء تحليل بروتيني. هذا يمثل ميزة على طرق تعدد الإرسال ذات القسم الكامل10,12. في جولة واحدة من المعالجة ، يقدم DSP طبقات متعددة من التحليل من خلال مسح العديد من أهداف البروتين عبر مناطق متعددة ذات أهمية.
DSP له تطبيقات في العديد من الإعدادات المرضية المختلفة. يعد DSP مفيدا بشكل خاص في تحليل الأورام ، حيث يمكن أن يرتبط التباين المكاني بالتحول الخلوي والتعبير التفاضلي للبروتين. على سبيل المثال ، تم استخدام DSP لمقارنة الملف البروتيني لسرطان الثدي بالبيئة المكروية للورم المجاورة. هذا يحمل آثارا مهمة لفهم التاريخ الطبيعي لهذا الورم وتطوره ، وكذلك الاستجابة المحتملة للعلاج13. تشمل السياقات الإضافية التي توضح تنوع DSP القياس الكمي المكاني لتنوع البروتين في سرطان البروستاتا14 ، وارتباط تعبير علامة الخلايا المناعية بتطور المرض في سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة 15 ، وإظهار التدرج الظهاري – الوسيطة لتعبير البروتين الذي يميز سرطان المبيض النقيلي عن سرطان المبيض الأولي الصافي16 . من خلال تنفيذ DSP ، نقوم بتوصيف التضاريس المكانية للبروتينات التي يمكن أن تؤثر على تكوين الورم وغزو الأورام الدبقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لتنوع البروتينات التي يمكن أن تؤثر على عدوانية الأورام الدبقية وفكرة أن العديد من هذه البروتينات لا تزال غير مكتشفة ، فإن طريقة قياس كمية البروتين عالية الإنتاجية هي نهج تكنولوجي مثالي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن البيانات المكانية في عينات الأورام غالبا ما ترتبط بالتعبير التفا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بدعم مختبر علم الجينوم السريري والتكنولوجيا المتقدمة في قسم علم الأمراض والطب المخبري في نظام دارتموث هيتشكوك الصحي. يقر المؤلفون أيضا بالمورد المشترك لعلم الأمراض في مركز دارتموث للسرطان مع منحة دعم مركز السرطان NCI 5P30 CA023108-37.
Materials
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -. T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii, , et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
