Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Summary

La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.

Abstract

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont associés à une morbidité et une mortalité élevées en raison de la nature infiltrante de la propagation tumorale. Ce sont des tumeurs morphologiquement complexes, avec un degré élevé de variabilité protéomique à la fois dans la tumeur elle-même et dans son microenvironnement hétérogène. Le potentiel malin de ces tumeurs est renforcé par la dérégulation des protéines impliquées dans plusieurs voies clés, y compris les processus qui maintiennent la stabilité cellulaire et préservent l’intégrité structurelle du microenvironnement. Bien qu’il y ait eu de nombreuses analyses de gliome en vrac et unicellulaire, il y a une relative rareté de stratification spatiale de ces données protéomiques. Comprendre les différences dans la distribution spatiale des facteurs tumorigènes et des populations de cellules immunitaires entre la tumeur intrinsèque, la bordure invasive et le microenvironnement offre des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents à la prolifération et à la propagation des tumeurs. Le profilage spatial numérique (DSP) représente une technologie puissante qui peut constituer la base de ces importantes analyses multicouches.

DSP est une méthode qui quantifie efficacement l’expression des protéines dans les régions spatiales spécifiées par l’utilisateur dans un échantillon de tissu. DSP est idéal pour étudier l’expression différentielle de plusieurs protéines dans et entre les régions de distinction, permettant plusieurs niveaux d’analyse quantitative et qualitative. Le protocole DSP est systématique et convivial, permettant une analyse spatiale personnalisée des données protéomiques. Dans cette expérience, des puces à ADN tissulaires sont construites à partir de biopsies de forage de glioblastome archivées. Ensuite, un panel d’anticorps est sélectionné, ciblant les protéines d’intérêt dans l’échantillon. Les anticorps, qui sont préconjugués aux oligonucléotides d’ADN photoclivables par UV, sont ensuite incubés avec l’échantillon de tissu pendant une nuit. Dans le cadre de la visualisation par microscopie à fluorescence des anticorps, les régions d’intérêt (ROI) dans lesquelles quantifier l’expression des protéines sont définies avec les échantillons. La lumière UV est ensuite dirigée vers chaque ROI, clivant les oligonucléotides d’ADN. Les oligonucléotides sont microaspirés et comptés dans chaque ROI, quantifiant la protéine correspondante sur une base spatiale.

Introduction

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont le type le plus courant de tumeur cérébrale maligne chez l’adulte et sont invariablement mortels. La propension des cellules de gliome à migrer largement dans le cerveau est un défi thérapeutique majeur. Le mécanisme par lequel ils se propagent implique une migration dirigée et une invasion incontrôlée. Il a été démontré que les cellules de gliome invasives présentent un tropisme et une migration le long des faisceaux de substance blanche¹, des recherches récentes impliquant la démyélinisation de ces voies comme une caractéristique protumorigène active². L’invasion est médiée par une transition épithélio-mésenchymateuse, dans laquelle les cellules de gliome acquièrent des propriétés mésenchymateuses en réduisant l’expression des gènes codant pour les protéines de la matrice extracellulaire et les molécules d’adhésion cellulaire, amplifiant la migration et facilitant la propagation à travers le microenvironnement tumoral ^3,4,5.

Au niveau moléculaire, la perturbation de plusieurs protéines qui confèrent une stabilité cellulaire et une interface avec des composants immunogènes a été démontrée⁶. Les gliomes infiltrants sont connus pour subir la suppression de protéines ayant des propriétés anti-apoptotiques (par exemple, PTEN)⁷. Ils surexpriment également des protéines qui favorisent l’évasion de la réponse immunitaire de l’hôte (p. ex. PD1/PDL1)⁸. La dérégulation de ces voies complexes augmente la tumorigénicité et augmente le potentiel malin.

Dans des échantillons de gliome invasif, l’objectif était d’évaluer l’expression différentielle de protéines essentielles à la croissance, à la survie et à la prolifération cellulaires, ainsi qu’à l’intégrité structurelle du microenvironnement entre les composants invasifs et non invasifs. De plus, nous avons cherché à étudier la régulation différentielle des protéines ayant un rôle immunogène actif, offrant un aperçu du mécanisme par lequel les défenses immunitaires de l’hôte compromis peuvent améliorer le potentiel prolifératif et invasif des gliomes. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’ampleur récente de la recherche démontrant comment les marqueurs immunitaires et les facteurs de dérégulation dans la malignité peuvent servir de cibles de l’immunothérapie. L’identification de cibles thérapeutiques viables parmi les nombreuses protéines impliquées dans l’immunosurveillance et la réactivité nécessite une approche très sensible et globale.

Compte tenu du large éventail de protéines candidates pouvant être étudiées, nous avons cherché une méthode semblable à l’immunohistochimie, mais avec une efficacité accrue du traitement des données. Dans le domaine de la biologie du cancer, DSP est apparu comme une technologie puissante avec des avantages importants par rapport aux outils alternatifs pour l’analyse et la quantification protéomique. La caractéristique du DSP est sa capacité de multiplexage à haut débit, permettant l’étude simultanée de plusieurs protéines différentes dans un échantillon, marquant une distinction importante des technologies standard mais à plus faible plex telles que l’immunohistochimie (IHC)^9,10. La caractéristique multiplex du DSP ne compromet pas sa fidélité en tant qu’outil quantitatif et analytique, comme le démontrent les études comparant le DSP à l’IHC. Lorsqu’il est utilisé pour la quantification protéomique d’échantillons de cancer du poumon non à petites cellules, par exemple, il a été démontré que le DSP donne des résultats similaires à IHC¹¹. En outre, DSP offre une spécification régionale personnalisable, dans laquelle les utilisateurs peuvent définir manuellement des régions dans lesquelles effectuer une analyse protéomique. Cela présente un avantage par rapport aux méthodes multiplex à section entière^10,12. En un seul cycle de traitement, DSP offre ainsi plusieurs couches d’analyse en examinant plusieurs cibles protéiques dans plusieurs régions d’intérêt.

DSP a des applications dans plusieurs contextes pathologiques différents. La DSP est particulièrement avantageuse dans l’analyse oncologique, car la variation spatiale peut être corrélée à la transformation cellulaire et à l’expression différentielle des protéines. Par exemple, le DSP a été utilisé pour comparer le profil protéomique du cancer du sein au microenvironnement tumoral adjacent. Cela comporte des implications importantes pour la compréhension de l’histoire naturelle de cette tumeur et de sa progression, ainsi que de la réponse potentielle au traitement¹³. D’autres contextes illustrant la polyvalence du DSP comprennent la quantification spatiale de la diversité des protéines dans le cancer de la prostate¹⁴, l’association de l’expression des marqueurs cellulaires immunitaires avec la progression de la maladie dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou 15 et la démonstration d’un gradient épithélial-mésenchymateux de l’expression protéique distinguant le cancer de l’ovaire métastatique du cancer primaire de l’ovaire à cellules claires¹⁶ . En implémentant DSP, nous caractérisons la topographie spatiale des protéines qui pourraient avoir un impact sur la tumorigenèse et l’invasion des gliomes.

Protocol

Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de Dartmouth-Hitchcock. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dont les échantillons de tissus ont été inclus dans cette étude. Voir la section Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole. 1. Préparation des diapositives<sup class="…

Representative Results

La figure 4 montre les résultats représentatifs d’une expérience DSP réalisée sur des échantillons de glioblastome. Une carte thermique est présentée, illustrant l’une des méthodes permettant de capturer visuellement des données à l’aide du logiciel DSP. Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Une gamme de couleurs de bleu à rouge indique une expression faible à élevée, respectivement. La variabilité de…

Discussion

Compte tenu de la diversité des protéines qui pourraient potentiellement influencer l’agressivité des gliomes et de l’idée que plusieurs de ces protéines restent non découvertes, une méthode de quantification des protéines à haut débit est une approche technologique idéale. De plus, étant donné que les données spatiales dans les échantillons oncologiques sont souvent corrélées avec l’expression différentielle¹⁸, l’intégration du profilage spatial dans l’approche de qua…

Materials

BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	Open detection system containing open containers in a reagent tray
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	contact company	Blocking reagent
Cy3 conjugation kit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 fluorescent antibody conjugation kit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	contact company	System for imaging and characterizing protein and RNA targets
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Controls for running GeoMX DSP experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis
IDH1-R132H antibody	Dianova, Hamburg, Germany	DIA-H09	Monoclonal antibody against human IDH1 R132H
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	Fully automated IHC stainer
Master Kit–12 reactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	contact company	Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		To create the tissue microarray block