A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.
Gliomas de infiltração difusa estão associados a alta morbidade e mortalidade devido à natureza infiltrativa da disseminação tumoral. São tumores morfologicamente complexos, com alto grau de variabilidade proteômica tanto no próprio tumor quanto em seu microambiente heterogêneo. O potencial maligno desses tumores é reforçado pela desregulação de proteínas envolvidas em várias vias-chave, incluindo processos que mantêm a estabilidade celular e preservam a integridade estrutural do microambiente. Embora tenha havido numerosas análises de glioma a granel e unicelular, há uma relativa escassez de estratificação espacial desses dados proteômicos. A compreensão das diferenças na distribuição espacial de fatores tumorigênicos e populações de células imunes entre o tumor intrínseco, a borda invasiva e o microambiente oferece informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes à proliferação e propagação do tumor. O perfil espacial digital (DSP) representa uma tecnologia poderosa que pode formar a base para essas importantes análises multicamadas.
O DSP é um método que quantifica eficientemente a expressão de proteínas dentro de regiões espaciais especificadas pelo usuário em uma amostra de tecido. O DSP é ideal para estudar a expressão diferencial de múltiplas proteínas dentro e entre regiões de distinção, permitindo múltiplos níveis de análise quantitativa e qualitativa. O protocolo DSP é sistemático e fácil de usar, permitindo a análise espacial personalizada de dados proteômicos. Neste experimento, microarranjos teciduais são construídos a partir de biópsias de núcleo de glioblastoma arquivadas. Em seguida, um painel de anticorpos é selecionado, visando proteínas de interesse dentro da amostra. Os anticorpos, que são pré-conjugados a oligonucleotídeos de DNA UV-fotoclevíveis, são então incubados com a amostra de tecido durante a noite. Sob a visualização por microscopia de fluorescência dos anticorpos, as regiões de interesse (ROIs) dentro das quais quantificar a expressão proteica são definidas com as amostras. A luz UV é então direcionada para cada ROI, clivando os oligonucleotídeos do DNA. Os oligonucleotídeos são microaspirados e contados dentro de cada ROI, quantificando a proteína correspondente em uma base espacial.
Gliomas de infiltração difusa são o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos e são invariavelmente letais. A propensão para as células do glioma migrarem extensivamente no cérebro é um grande desafio terapêutico. O mecanismo pelo qual eles se espalham envolve migração dirigida e invasão descontrolada. Demonstrou-se que as células invasivas do glioma exibem tropismo e migração ao longo dos tratos da substância branca1, com pesquisas recentes implicando a desmielinização desses tratos como uma característica ativa e protumorigênica2. A invasão é mediada por uma transição epitelial-mesenquimal, na qual as células do glioma adquirem propriedades mesenquimais, reduzindo a expressão de genes que codificam proteínas da matriz extracelular e moléculas de adesão celular, amplificando a migração e facilitando a propagação através do microambiente tumoral 3,4,5.
No nível molecular, tem sido demonstrada a ruptura de diversas proteínas que conferem estabilidade celular e interface com componentes imunogênicos6. Sabe-se que os gliomas infiltrativos sofrem supressão de proteínas com propriedades antiapoptóticas (por exemplo, PTEN)7. Eles também superexpressam proteínas que promovem a evasão da resposta imune do hospedeiro (por exemplo, PD1/PDL1)8. A desregulação dessas vias complexas aumenta a tumorigenicidade e aumenta o potencial maligno.
Dentro de amostras de glioma invasivo, o objetivo foi avaliar a expressão diferencial de proteínas fundamentais para o crescimento, sobrevivência e proliferação celular, e para a integridade estrutural do microambiente entre componentes invasivos e não invasivos. Além disso, procuramos estudar a regulação diferencial de proteínas com um papel imunogênico ativo, oferecendo informações sobre o mecanismo pelo qual as defesas imunológicas comprometidas do hospedeiro podem aumentar o potencial proliferativo e invasivo dos gliomas. Isso é especialmente relevante, dada a recente amplitude de pesquisas que demonstram como os marcadores imunológicos e os fatores de desregulação na malignidade podem servir como alvos da imunoterapia. A identificação de alvos terapêuticos viáveis entre as muitas proteínas envolvidas na imunovigilância e reatividade requer uma abordagem altamente sensível e abrangente.
Dada a ampla gama de proteínas candidatas que podem ser estudadas, buscamos um método semelhante à imuno-histoquímica, mas com maior eficiência no processamento de dados. Dentro do campo da biologia do câncer, o DSP emergiu como uma tecnologia poderosa com vantagens importantes sobre ferramentas alternativas para análise e quantificação proteômica. A marca registrada do DSP é sua capacidade de multiplexação de alto rendimento, permitindo o estudo simultâneo de várias proteínas diferentes dentro de uma amostra, marcando uma distinção importante das tecnologias padrão, mas de baixo plexo, como a imuno-histoquímica (IHC)9,10. A característica multiplex do DSP não compromete sua fidelidade como ferramenta quantitativa e analítica, como demonstrado por estudos comparando DSP com IHC. Quando usado para quantificação proteômica de espécimes de câncer de pulmão de células não pequenas, por exemplo, o DSP demonstrou ter resultados semelhantes aos da IHC11. Além disso, o DSP oferece especificação regional personalizável, na qual os usuários podem definir manualmente as regiões dentro das quais executar a análise proteômica. Isso apresenta uma vantagem sobre os métodos multiplex de seção inteira10,12. Em uma única rodada de processamento, o DSP oferece várias camadas de análise, pesquisando vários alvos de proteínas em várias regiões de interesse.
DSP tem aplicações em vários contextos patológicos diferentes. A DSP é especialmente vantajosa na análise oncológica, pois a variação espacial pode se correlacionar com a transformação celular e a expressão diferencial de proteínas. Por exemplo, o DSP tem sido usado para comparar o perfil proteômico do câncer de mama com o microambiente tumoral adjacente. Isso traz implicações importantes para a compreensão da história natural desse tumor e sua progressão, bem como para a potencial resposta ao tratamento13. Contextos adicionais que ilustram a versatilidade do DSP incluem quantificação espacial da diversidade proteica no câncer de próstata14, associação da expressão de marcadores de células imunes com a progressão da doença no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço 15 e demonstração de um gradiente epitelial-mesenquimal de expressão proteica distinguindo o câncer de ovário metastático de células claras primário16 . Ao implementar o DSP, caracterizamos a topografia espacial de proteínas que poderiam impactar a tumorigênese e a invasão de gliomas.
Dada a diversidade de proteínas que poderiam potencialmente influenciar a agressividade dos gliomas e a noção de que várias dessas proteínas permanecem desconhecidas, um método de quantificação de proteínas de alto rendimento é uma abordagem tecnológica ideal. Além disso, dado que os dados espaciais em amostras oncológicas muitas vezes se correlacionam com a expressão diferencial18, a incorporação do perfil espacial na abordagem de quantificação de proteínas permite uma análise…
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o apoio do Laboratório de Genômica Clínica e Tecnologia Avançada do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial do Dartmouth Hitchcock Health System. Os autores também reconhecem o Recurso Compartilhado de Patologia no Dartmouth Cancer Center com o NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |