La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.
Los gliomas infiltrantes difusos se asocian con una alta morbilidad y mortalidad debido a la naturaleza infiltrativa de la diseminación tumoral. Son tumores morfológicamente complejos, con un alto grado de variabilidad proteómica tanto en el propio tumor como en su microambiente heterogéneo. El potencial maligno de estos tumores se ve reforzado por la desregulación de las proteínas involucradas en varias vías clave, incluidos los procesos que mantienen la estabilidad celular y preservan la integridad estructural del microambiente. Aunque se han realizado numerosos análisis masivos y de glioma unicelular, existe una relativa escasez de estratificación espacial de estos datos proteómicos. Comprender las diferencias en la distribución espacial de los factores tumorígenos y las poblaciones de células inmunitarias entre el tumor intrínseco, el borde invasivo y el microambiente ofrece información valiosa sobre los mecanismos subyacentes a la proliferación y propagación del tumor. El perfil espacial digital (DSP) representa una tecnología poderosa que puede formar la base para estos importantes análisis multicapa.
DSP es un método que cuantifica eficientemente la expresión de proteínas dentro de las regiones espaciales especificadas por el usuario en una muestra de tejido. DSP es ideal para estudiar la expresión diferencial de múltiples proteínas dentro y entre regiones de distinción, lo que permite múltiples niveles de análisis cuantitativo y cualitativo. El protocolo DSP es sistemático y fácil de usar, lo que permite un análisis espacial personalizado de los datos proteómicos. En este experimento, los microarrays de tejido se construyen a partir de biopsias archivadas del núcleo del glioblastoma. A continuación, se selecciona un panel de anticuerpos, dirigidos a proteínas de interés dentro de la muestra. Los anticuerpos, que se conjugan previamente a oligonucleótidos de ADN fotocleavable UV, se incuban con la muestra de tejido durante la noche. Bajo microscopía de fluorescencia visualización de los anticuerpos, las regiones de interés (ROIs) dentro de las cuales cuantificar la expresión de proteínas se definen con las muestras. La luz UV se dirige a cada ROI, dividiendo los oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos son microaspirados y contados dentro de cada ROI, cuantificando la proteína correspondiente sobre una base espacial.
Los gliomas infiltrantes difusamente son el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos y son invariablemente letales. La propensión de las células de glioma a migrar extensamente en el cerebro es un desafío terapéutico importante. El mecanismo por el cual se propagan implica la migración dirigida y la invasión sin control. Se ha demostrado que las células de glioma invasivo exhiben tropismo y migración a lo largo de los tractos de sustancia blanca1, con investigaciones recientes que implican la desmielinización de estos tractos como una característica activa y protumorigénica2. La invasión está mediada por una transición epitelial-mesenquimal, en la que las células gliomas adquieren propiedades mesenquimales al reducir la expresión de genes que codifican proteínas de la matriz extracelular y moléculas de adhesión celular, amplificando la migración y facilitando la propagación a través del microambiente tumoral 3,4,5.
A nivel molecular, se ha demostrado la disrupción de varias proteínas que confieren estabilidad celular e interactúan con componentes inmunogénicos6. Se sabe que los gliomas infiltrativos sufren supresión de proteínas con propiedades antiapoptóticas (por ejemplo, PTEN)7. También sobreexpresan proteínas que promueven la evasión de la respuesta inmune del huésped (por ejemplo, PD1/PDL1)8. La desregulación de estas vías complejas aumenta la tumorigenicidad y aumenta el potencial maligno.
Dentro de muestras de glioma invasivo, el objetivo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas clave para el crecimiento, la supervivencia y la proliferación celular, y para la integridad estructural del microambiente entre componentes invasivos y no invasivos. Además, buscamos estudiar la regulación diferencial de proteínas con un papel inmunogénico activo, ofreciendo información sobre el mecanismo por el cual las defensas inmunes comprometidas del huésped pueden mejorar el potencial proliferativo e invasivo de los gliomas. Esto es especialmente relevante dada la reciente amplitud de la investigación que demuestra cómo los marcadores inmunes y los impulsores de la desregulación en la malignidad pueden servir como objetivos de la inmunoterapia. La identificación de dianas terapéuticas viables entre las muchas proteínas implicadas en la inmunovigilancia y la reactividad requiere un enfoque altamente sensible y completo.
Dada la amplia gama de proteínas candidatas que se pueden estudiar, buscamos un método similar a la inmunohistoquímica pero con una mayor eficiencia en el procesamiento de datos. Dentro del campo de la biología del cáncer, DSP se ha convertido en una tecnología poderosa con importantes ventajas sobre herramientas alternativas para el análisis proteómico y la cuantificación. El sello distintivo de DSP es su capacidad de multiplexación de alto rendimiento, que permite el estudio simultáneo de varias proteínas diferentes dentro de una muestra, marcando una distinción importante de las tecnologías estándar pero de plexación inferior como la inmunohistoquímica (IHC)9,10. La característica múltiplex de DSP no compromete su fidelidad como herramienta cuantitativa y analítica, como lo demuestran los estudios que comparan DSP con IHC. Cuando se utiliza para la cuantificación proteómica de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas, por ejemplo, se ha demostrado que el DSP tiene resultados similares a IHC11. Además, DSP ofrece una especificación regional personalizable, en la que los usuarios pueden definir manualmente las regiones dentro de las cuales realizar el análisis proteómico. Esto presenta una ventaja sobre los métodos multiplexores de sección completa10,12. En una sola ronda de procesamiento, DSP ofrece múltiples capas de análisis mediante el estudio de varios objetivos de proteínas en múltiples regiones de interés.
DSP tiene aplicaciones en varios entornos patológicos diferentes. DSP es especialmente ventajoso en el análisis oncológico, ya que la variación espacial puede correlacionarse con la transformación celular y la expresión diferencial de proteínas. Por ejemplo, DSP se ha utilizado para comparar el perfil proteómico del cáncer de mama con el microambiente tumoral adyacente. Esto conlleva implicaciones importantes para la comprensión de la historia natural de este tumor y su progresión, así como la posible respuesta al tratamiento13. Otros contextos que ilustran la versatilidad del DSP incluyen la cuantificación espacial de la diversidad de proteínas en el cáncer de próstata14, la asociación de la expresión del marcador de células inmunitarias con la progresión de la enfermedad en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello 15 y la demostración de un gradiente epitelial-mesenquimal de la expresión de proteínas que distingue el cáncer de ovario metastásico del primario de células claras16 . Mediante la implementación de DSP, caracterizamos la topografía espacial de las proteínas que podrían afectar la tumorigénesis y la invasión de gliomas.
Dada la diversidad de proteínas que podrían influir potencialmente en la agresividad de los gliomas y la noción de que varias de estas proteínas permanecen sin descubrir, un método de cuantificación de proteínas de alto rendimiento es un enfoque tecnológico ideal. Además, dado que los datos espaciales en muestras oncológicas a menudo se correlacionan con la expresión diferencial18, la incorporación del perfil espacial en el enfoque de cuantificación de proteínas permite un análisis …
The authors have nothing to disclose.
Los autores reconocen el apoyo del Laboratorio de Genómica Clínica y Tecnología Avanzada del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio del Sistema de Salud Dartmouth Hitchcock. Los autores también reconocen el Recurso Compartido de Patología en el Centro Oncológico de Dartmouth con la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico del NCI 5P30 CA023108-37.
BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
IDH1-R132H antibody | Dianova, Hamburg, Germany | DIA-H09 | Monoclonal antibody against human IDH1 R132H |
LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
Master Kit–12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |