Este protocolo describe la metodología para el seguimiento no invasivo de células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos in vivo con una plataforma clínicamente disponible.
Las células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígeno quimérico (CAR) han mostrado resultados sin precedentes en ensayos clínicos fundamentales para pacientes con neoplasias malignas de células B o mieloma múltiple (MM). Sin embargo, numerosos obstáculos limitan la eficacia y prohíben el uso generalizado de terapias de células T con CAR debido al tráfico deficiente y la infiltración en los sitios tumorales, así como la falta de persistencia in vivo. Además, las toxicidades potencialmente mortales, como el síndrome de liberación de citoquinas o la neurotoxicidad, son las principales preocupaciones. La obtención de imágenes y el seguimiento eficientes y sensibles de las células T con CAR permiten la evaluación del tráfico, la expansión y la caracterización in vivo de las células T con T y permiten el desarrollo de estrategias para superar las limitaciones actuales de la terapia con células T con CAR. Este artículo describe la metodología para incorporar el simportador de yoduro de sodio (NIS) en células T CAR y para imágenes de células T CAR utilizando tomografía por emisión de tetrafluoroborato-positrón [18F] ([18F]TFB-PET) en modelos preclínicos. Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar a otras construcciones CAR y genes diana además de los utilizados para este estudio.
La terapia con células T (CAR T) receptoras de antígeno quimérico es un abordaje rápidamente emergente y potencialmente curativo en neoplasias hematológicas malignas1,2,3,4,5,6. Se informaron resultados clínicos extraordinarios después de la terapia con células T CAR T (CART19) dirigida por CD19 o antígeno de maduración de células B (BCMA)CAR2. Esto llevó a la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) a la aprobación de células CART19 para el linfoma agresivo de células B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 y lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblástica aguda (Tisa-Cel)5,8, linfoma de células del manto (brexucabtagene autoleuce)9 y linfoma folicular (Axi-Cel)10 . Más recientemente, la FDA aprobó la terapia de células T CAR dirigida por BCMA en pacientes con mieloma múltiple (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Además, la terapia de células T con CAR para la leucemia linfocítica crónica (LLC) se encuentra en etapa tardía de desarrollo clínico y se espera que reciba la aprobación de la FDA en los próximos tres años1.
A pesar de los resultados sin precedentes de la terapia de células T con CAR, su uso generalizado está limitado por 1) la insuficiente expansión in vivo de las células T con CAR o el tráfico deficiente a los sitios tumorales, lo que conduce a tasas más bajas de respuesta duradera12,13 y 2) el desarrollo de eventos adversos potencialmente mortales, incluido el síndrome de liberación de citoquinas (SRC)14,15 . Las características distintivas del SRC incluyen no solo la activación inmune que resulta en niveles elevados de citoquinas / quimiocinas inflamatorias, sino también la proliferación masiva de células T después de la infusión de células T con CAR15,16. Por lo tanto, el desarrollo de una estrategia validada de grado clínico para obtener imágenes de células T CAR in vivo permitiría 1) el seguimiento de células T CAR en tiempo real in vivo para monitorear su tráfico a sitios tumorales y descubrir posibles mecanismos de resistencia, y 2) monitorear la expansión de células T CAR y potencialmente predecir sus toxicidades, como el desarrollo de CRS.
Las características clínicas del SRC leve son fiebre alta, fatiga, dolor de cabeza, erupción cutánea, diarrea, artralgia, mialgia y malestar general. En el SRC más grave, los pacientes pueden desarrollar taquicardia/hipotensión, fuga capilar, disfunción cardíaca, insuficiencia renal/hepática y coagulación intravascular diseminada17,18. En general, se ha demostrado que el grado de elevación de las citoquinas, incluyendo interferón-gamma, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, interleucina (IL)-10 e IL-6, se correlaciona con la gravedad de los síntomas clínicos17,19. Sin embargo, la aplicación extensiva de monitoreo de citoquinas séricas “en tiempo real” para predecir CRS es difícil debido al alto costo y la disponibilidad limitada. Para explotar las características beneficiosas de la terapia de células T con CAR, las imágenes no invasivas de las células T adoptivas se pueden utilizar potencialmente para predecir la eficacia, las toxicidades y la recaída después de la infusión de células T con CAR.
Varios investigadores han desarrollado estrategias para utilizar imágenes basadas en radionúclidos con tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), que proporciona alta resolución y alta sensibilidad20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 para el visualización y monitoreo in vivo del tráfico de células T CAR. Entre esas estrategias de imagen basadas en radionúclidos, se ha desarrollado el simportador de yoduro de sodio (NIS) como una modalidad sensible para obtener imágenes de células y virus mediante tomografías PET31,32. Las imágenes de células T NIS+CAR con [18F]TFB-PET son una tecnología sensible, eficiente y conveniente para evaluar y diagnosticar la expansión, el tráfico y la toxicidad de las células T CAR30. Este protocolo describe 1) el desarrollo de células T NIS+CAR a través de la transducción dual con alta eficacia y 2) una metodología para obtener imágenes de células T NIS+CAR con [18F]TFB-PET. Las células T BCMA-CAR para MM se utilizan como un modelo de prueba de concepto para describir NIS como un reportero para imágenes de células T CAR. Sin embargo, estas metodologías se pueden aplicar a cualquier otra terapia de células T con CAR.
Este artículo describe una metodología para incorporar NIS en células T CAR e imágenes de células T CAR infundidas in vivo a través de [18F]TFB-PET. Como prueba de concepto, las células T NIS+BCMA-CAR se generaron a través de la transducción dual. Recientemente hemos informado que la incorporación de NIS en las células T CAR no perjudica las funciones y la eficacia in vivo de las células T CAR y permite el tráfico y la expansión de las células T CAR…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte a través de la canalización K2R (SSK) de Mayo Clinic, el Centro de Medicina Individualizada (SSK) de Mayo Clinic y la Fundación Predolin (RS). Las figuras 1, 2 y 4 se crearon con BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |