Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.
T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um chimäre Antigenrezeptoren (CAR) zu exprimieren, haben in zulassungsrelevanten klinischen Studien für Patienten mit B-Zell-Malignomen oder multiplem Myelom (MM) beispiellose Ergebnisse gezeigt. Zahlreiche Hindernisse schränken jedoch die Wirksamkeit ein und verbieten den weit verbreiteten Einsatz von CAR-T-Zelltherapien aufgrund des schlechten Handels und der Infiltration in Tumorstellen sowie der mangelnden Persistenz in vivo. Darüber hinaus sind lebensbedrohliche Toxizitäten wie das Zytokinfreisetzungssyndrom oder die Neurotoxizität ein großes Problem. Effiziente und empfindliche Bildgebung und Verfolgung von CAR-T-Zellen ermöglicht die Bewertung des Transports, der Expansion und der In-vivo-Charakterisierung von T-Zellen und ermöglicht die Entwicklung von Strategien zur Überwindung der derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zelltherapie. Dieses Papier beschreibt die Methodik für den Einbau des Natriumiodid-Symporters (NIS) in CAR-T-Zellen und für die CAR-T-Zellbildgebung mittels [18F]tetrafluoroborat-Positronen-Emissionstomographie ([18F]TFB-PET) in präklinischen Modellen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können zusätzlich zu den für diese Studie verwendeten auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden.
Die Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Zelltherapie ist ein sich schnell entwickelnder und potenziell heilender Ansatz bei hämatologischen Malignomen1,2,3,4,5,6. Außergewöhnliche klinische Ergebnisse wurden nach CD19-gerichteter CAR T (CART19) oder B-Zellreifungsantigen (BCMA) CAR T-Zelltherapie2 berichtet. Dies führte zur Zulassung von CART19-Zellen für aggressive B-Zell-Lymphome (Axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, Tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 und Lisocabtagene maraleucel)7, akute lymphatische Leukämie (Tisa-Cel)5,8, Mantelzelllymphom (brexucabtagene autoleuce)9 und follikuläres Lymphom (Axi-Cel)10 . Zuletzt genehmigte die FDA die BCMA-gerichtete CAR-T-Zelltherapie bei Patienten mit multiplem Myelom (MM) (Idecabtagen-Vikleucel)11. Darüber hinaus befindet sich die CAR-T-Zelltherapie bei chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) in der späten klinischen Entwicklung und wird voraussichtlich innerhalb der nächsten drei Jahre die FDA-Zulassung erhalten1.
Trotz der beispiellosen Ergebnisse der CAR-T-Zelltherapie ist ihre weit verbreitete Anwendung begrenzt durch 1) unzureichende In-vivo-CAR-T-Zellexpansion oder schlechten Transport zu Tumorstellen, was zu niedrigeren Raten dauerhafter Reaktion führt12,13 und 2) die Entwicklung lebensbedrohlicher unerwünschter Ereignisse, einschließlich des Zytokinfreisetzungssyndroms (CRS)14,15 . Zu den Kennzeichen von CRS gehören nicht nur die Immunaktivierung, die zu erhöhten Spiegeln von entzündlichen Zytokinen / Chemokinen führt, sondern auch eine massive T-Zell-Proliferation nach CAR-T-Zell-Infusion15,16. Daher würde die Entwicklung einer validierten, klinischen Strategie zur Abbildung von CAR-T-Zellen in vivo 1) CAR-T-Zell-Tracking in Echtzeit in vivo ermöglichen , um ihren Transport zu Tumorstellen zu überwachen und potenzielle Resistenzmechanismen aufzudecken, und 2) die Überwachung der CAR-T-Zellexpansion und möglicherweise die Vorhersage ihrer Toxizitäten wie die Entwicklung von CRS.
Klinische Merkmale von leichtem CRS sind hohes Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Hautausschlag, Durchfall, Arthralgie, Myalgie und Unwohlsein. Bei schwererem CRS können Patienten Tachykardie/Hypotonie, Kapillarleck, Herzfunktionsstörungen, Nieren- / Leberversagen und eine disseminierte intravaskuläre Koagulation entwickeln17,18. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass der Grad der Erhöhung von Zytokinen, einschließlich Interferon-gamma, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Interleukin (IL)-10 und IL-6, mit der Schwere der klinischen Symptome korreliert17,19. Die umfangreiche Anwendung der “Echtzeit” -Serumzytokinüberwachung zur Vorhersage von CRS ist jedoch aufgrund der hohen Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit schwierig. Um die vorteilhaften Eigenschaften der CAR-T-Zelltherapie zu nutzen, kann die nicht-invasive Bildgebung von adoptiven T-Zellen potenziell verwendet werden, um die Wirksamkeit, Toxizität und den Rückfall nach der CAR-T-Zellinfusion vorherzusagen.
Mehrere Forscher haben Strategien entwickelt, um radionuklidbasierte Bildgebung mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) zu verwenden, die eine hohe Auflösung und hohe Empfindlichkeit bietet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 für die In-vivo-Visualisierung und Monitoring des CAR-T-Zell-Handels. Unter diesen Radionuklid-basierten Bildgebungsstrategien wurde der Natriumiodid-Symporter (NIS) als empfindliche Modalität zur Abbildung von Zellen und Viren mithilfe von PET-Scans entwickelt31,32. Die NIS+CAR-T-Zellbildgebung mit [18F]TFB-PET ist eine empfindliche, effiziente und praktische Technologie zur Beurteilung und Diagnose der Ausdehnung, des Handels und der Toxizität von CAR-T-Zellen30. Dieses Protokoll beschreibt 1) die Entwicklung von NIS+CAR T-Zellen durch duale Transduktion mit hoher Wirksamkeit und 2) eine Methodik zur Bildgebung von NIS+CAR T-Zellen mit [18F]TFB-PET-Scan. BCMA-CAR-T-Zellen für MM werden als Proof-of-Concept-Modell verwendet, um NIS als Reporter für CAR-T-Zell-Imaging zu beschreiben. Diese Methoden können jedoch auf jede andere CAR-T-Zelltherapie angewendet werden.
Dieses Papier beschreibt eine Methodik für die Integration von NIS in CAR-T-Zellen und die Bildgebung von infundierten CAR-T-Zellen in vivo durch [18F]TFB-PET. Als Proof of Concept wurden NIS+BCMA-CAR T-Zellen mittels dualer Transduktion erzeugt. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Integration von NIS in CAR-T-Zellen die Funktionen und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in vivo nicht beeinträchtigt und den Transport und die Expansion von CAR-T-Zellen ermöglic…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Mayo Clinic K2R-Pipeline (SSK), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) und die Predolin Foundation (RS) unterstützt. Die Abbildungen 1, 2 und 4 wurden mit BioRender.com erstellt.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |