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Cancer Research

Imagerie dynamique des lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique avec [18F]Tomographie par émission de positons tétrafluoroborates/Tomodensitométrie

Published: February 17, 2022
doi:
10.3791/62334
, , , , , , , , , ,
1T Cell Engineering,Mayo Clinic, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, 3Department of Radiology,Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD,Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, 6Department of Immunology,Mayo Clinic

Summary

Ce protocole décrit la méthodologie de suivi non invasif des lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs d’antigènes chimériques in vivo avec une plate-forme cliniquement disponible.

Abstract

Les lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs de l’antigène chimérique (CAR) ont montré des résultats sans précédent dans des essais cliniques pivots chez des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B ou de myélome multiple (MM). Cependant, de nombreux obstacles limitent l’efficacité et interdisent l’utilisation généralisée des thérapies à base de cellules CAR-T en raison d’un mauvais trafic et d’une infiltration dans les sites tumoraux ainsi que d’un manque de persistance in vivo. De plus, les toxicités potentiellement mortelles, telles que le syndrome de libération de cytokines ou la neurotoxicité, sont des préoccupations majeures. L’imagerie et le suivi efficaces et sensibles des cellules CAR-T permettent l’évaluation du trafic, de l’expansion et de la caractérisation in vivo des lymphocytes T et permettent le développement de stratégies pour surmonter les limites actuelles de la thérapie cellulaire CAR-T. Cet article décrit la méthodologie pour incorporer le symporteur d’iodure de sodium (NIS) dans les cellules CAR T et pour l’imagerie des cellules CAR T en utilisant la tomographie par émission de tétrafluoroborate-positron [18F] ([18F]TFB-PET) dans des modèles précliniques. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles en plus de ceux utilisés pour cette étude.

Introduction

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CAR T) est une approche émergente et potentiellement curative dans les hémopathies malignes1,2,3,4,5,6. Des résultats cliniques extraordinaires ont été rapportés après une thérapie par cellules CAR T (CART19) dirigée par CD19 ou par antigène de maturation des cellules B (BCMA)2. Cela a conduit à l’approbation par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis des cellules CART19 pour le lymphome agressif à cellules B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 et lisocabtagene maraleucel)7, la leucémie lymphoblastique aiguë (Tisa-Cel)5,8, le lymphome à cellules du manteau (brexucabtagene autoleuce)9 et le lymphome folliculaire (Axi-Cel)10 . Plus récemment, la FDA a approuvé la thérapie cellulaire CAR-T dirigée par BCMA chez les patients atteints de myélome multiple (MM) (idecabtagene vicleucel)11. De plus, la thérapie par cellules CAR-T pour la leucémie lymphoïde chronique (LLC) est à un stade avancé de développement clinique et devrait recevoir l’approbation de la FDA au cours des trois prochaines années1.

Malgré les résultats sans précédent de la thérapie par cellules CAR-T, son utilisation généralisée est limitée par 1) une expansion insuffisante in vivo des cellules CAR-T ou un mauvais trafic vers les sites tumoraux, ce qui entraîne des taux plus faibles de réponse durable12,13 et 2) le développement d’événements indésirables potentiellement mortels, y compris le syndrome de libération de cytokines (SRC)14,15 . Les caractéristiques du SRC comprennent non seulement l’activation immunitaire entraînant des niveaux élevés de cytokines inflammatoires / chimiokines, mais aussi la prolifération massive des lymphocytes T après perfusion de cellules CAR-T15,16. Ainsi, le développement d’une stratégie validée de qualité clinique pour imager les cellules CAR T in vivo permettrait 1) le suivi des cellules CAR T en temps réel in vivo pour surveiller leur trafic vers les sites tumoraux et découvrir les mécanismes potentiels de résistance, et 2) la surveillance de l’expansion des cellules CAR T et potentiellement prédire leurs toxicités telles que le développement de CRS.

Les caractéristiques cliniques d’un SRC léger sont une forte fièvre, de la fatigue, des maux de tête, des éruptions cutanées, de la diarrhée, de l’arthralgie, de la myalgie et un malaise. Dans les CAS plus sévères, les patients peuvent développer une tachycardie/hypotension, une fuite capillaire, un dysfonctionnement cardiaque, une insuffisance rénale/hépatique et une coagulation intravasculaire disséminée17,18. En général, il a été démontré que le degré d’élévation des cytokines, y compris l’interféron-gamma, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages, l’interleukine (IL)-10 et l’IL-6, est en corrélation avec la gravité des symptômes cliniques17,19. Cependant, l’application étendue de la surveillance des cytokines sériques « en temps réel » pour prédire le SRC est difficile en raison du coût élevé et de la disponibilité limitée. Pour exploiter les caractéristiques bénéfiques de la thérapie par cellules CAR-T, l’imagerie non invasive des lymphocytes T adoptifs peut être potentiellement utilisée pour prédire l’efficacité, les toxicités et la rechute après perfusion de cellules CAR-T.

Plusieurs chercheurs ont mis au point des stratégies pour utiliser l’imagerie à base de radionucléides avec la tomographie par émission de positons (TEP) ou la tomodensitométrie par émission monophotonique (TEMP), qui fournit une haute résolution et une sensibilité élevées20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 pour le visualisation et surveillance in vivo du trafic de cellules CAR-T. Parmi ces stratégies d’imagerie à base de radionucléides, le symporteur d’iodure de sodium (NIS) a été développé comme une modalité sensible aux cellules d’imagerie et aux virus à l’aide de TEP31,32. L’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET est une technologie sensible, efficace et pratique pour évaluer et diagnostiquer l’expansion, le trafic et la toxicité des cellules CAR-T30. Ce protocole décrit 1) le développement de cellules NIS+CAR T par double transduction avec une grande efficacité et 2) une méthodologie d’imagerie des cellules NIS+CAR T avec [18F]TFB-PET scan. Les cellules BCMA-CAR T pour MM sont utilisées comme modèle de preuve de concept pour décrire NIS en tant que rapporteur pour l’imagerie des cellules CAR T. Cependant, ces méthodologies peuvent être appliquées à toute autre thérapie cellulaire CAR-T.

Protocol

Le protocole suit les lignes directrices du comité d’examen institutionnel de la clinique Mayo, du comité de biosécurité institutionnel et du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la clinique Mayo. 1. Production de cellules NIS+ BCMA-CAR T REMARQUE : Ce protocole suit les lignes directrices du Comité d’examen institutionnel de la Mayo Clinic (CISR 17-008762) et du Comité de biosécurité institutionnelle (IBC Bios000000…

Representative Results

La figure 1 représente les étapes de génération des cellules NIS+BCMA-CAR T. Le jour 0, isolez les PBMC, puis isolez les lymphocytes T par sélection négative. Ensuite, stimulez les lymphocytes T avec des billes anti-CD3/CD28. Le jour 1, transduire les lymphocytes T avec les lentivirus NIS et BCMA-CAR. Aux jours 3, 4 et 5, comptez les lymphocytes T et nourrissez-les avec un milieu pour ajuster la concentration à 1,0 × 106/mL. Pour les lymphocytes T transduites pa…

Discussion

Cet article décrit une méthodologie pour incorporer le NIS dans les cellules CAR T et l’imagerie des cellules CAR T perfusées in vivo par [18F]TFB-PET. Comme preuve de concept, les cellules NIS+BCMA-CAR T ont été générées par double transduction. Nous avons récemment signalé que l’incorporation de NIS dans les cellules CAR-T n’altère pas les fonctions et l’efficacité des cellules CAR-T in vivo et permet le trafic et l’expansion des cellules C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été en partie soutenu par le pipeline K2R de la Mayo Clinic (SSK), le Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) et la Predolin Foundation (RS). Les figures 1, 2 et 4 ont été créées avec BioRender.com.

Materials

22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
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Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).
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