该协议描述了非侵入性跟踪T细胞的方法,该T细胞经过基因工程改造,以使用临床可用的平台 在体内 表达嵌合抗原受体。
经过基因工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞在B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤(MM)患者的关键临床试验中显示出前所未有的结果。然而,由于运输和浸润肿瘤部位以及体内缺乏持久性,许多障碍限制了疗效并禁止了CAR T细胞疗法的广泛使用。此外,危及生命的毒性,如细胞因子释放综合征或神经毒性,是主要问题。对CAR T细胞进行高效和灵敏的成像和跟踪,可以评估T细胞的运输,扩增和体内表征,并允许制定策略来克服CAR T细胞治疗的当前局限性。本文描述了在临床前模型中使用[18F]四氟硼酸盐 – 正电子发射断层扫描([18F]TFB-PET)在CAR T细胞中掺入碘化钠共排(NIS)和CAR T细胞成像的方法。除了用于本研究的方法外,该协议中描述的方法还可以应用于其他CAR构建体和靶基因。
嵌合抗原受体 T (CAR T) 细胞疗法是血液系统恶性肿瘤中一种迅速出现且具有潜在治愈意义的方法1,2,3,4,5,6。在CD19指导的CAR T(CART19)或B细胞成熟抗原(BCMA)CAR T细胞治疗后报告了非凡的临床结果2。这导致美国食品和药物管理局(FDA)批准CART19细胞用于侵袭性B细胞淋巴瘤(axicabtagene ciloleucel(Axi-Cel)4,tisagenlecleucel(Tisa-Cel)3和lisocabtagene maraleucel)7,急性淋巴细胞白血病(Tisa-Cel)5,8,套细胞淋巴瘤(brexucabtagene autoleuce)9和滤泡性淋巴瘤(Axi-Cel)10.最近,FDA批准了BCMA指导的CAR T细胞疗法用于多发性骨髓瘤(MM)(idecabtagene vicleucel)患者11。此外,用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的CAR T细胞疗法正处于后期临床开发阶段,预计将在未来三年内获得FDA批准1。
尽管CAR T细胞疗法取得了前所未有的成果,但其广泛使用受到以下因素的限制:1) 体内 CAR T细胞扩增不足或向肿瘤部位的运输不良,导致持久反应率降低12,13和2)危及生命的不良事件的发展,包括细胞因子释放综合征(CRS)14,15.CRS的标志不仅包括导致炎症细胞因子/趋化因子水平升高的免疫激活,还包括CAR T细胞输注后的大量T细胞增殖15,16。因此,开发一种经过验证的临床级策略 来对体内 CAR T细胞进行成像将允许1) 体内 实时CAR T细胞跟踪,以监测它们向肿瘤部位的运输并揭示潜在的耐药机制,以及2)监测CAR T细胞扩增并可能预测其毒性,例如CRS的发展。
轻度CRS的临床特征是高烧、疲劳、头痛、皮疹、腹泻、关节痛、肌痛和不适。在更严重的CRS中,患者可能出现心动过速/低血压,毛细血管渗漏,心功能不全,肾/肝衰竭和弥散性血管内凝血17,18。一般而言,细胞因子(包括干扰素-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 (IL)-10 和 IL-6)的升高程度已被证明与临床症状的严重程度相关17,19。然而,由于成本高且可用性有限,广泛应用“实时”血清细胞因子监测来预测CRS是困难的。为了利用CAR T细胞疗法的有益特性,可以潜在地利用过继T细胞的非侵入性成像来预测CAR T细胞输注后的疗效,毒性和复发。
一些研究人员已经开发出使用基于放射性核素的成像与正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的策略,其提供高分辨率和高灵敏度20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30CAR T细胞转运的体内可视化和监测。在这些基于放射性核素的成像策略中,碘化钠共排量(NIS)已被开发为使用PET扫描对细胞和病毒进行成像的灵敏方式31,32。使用 [18F]TFB-PET 进行 NIS+CAR T 细胞成像是一种灵敏、高效且方便的技术,可用于评估和诊断 CAR T 细胞扩增、转运和毒性30。该协议描述了1)通过具有高效率的双重转导开发NIS + CAR T细胞和2)用[18F]TFB-PET扫描对NIS + CAR T细胞进行成像的方法。然而,这些方法可以应用于任何其他CAR T细胞疗法。
本文描述了一种将NIS掺入CAR T细胞并通过[18F]TFB-PET在体内对注入的CAR T细胞进行成像的方法。作为概念验证,NIS + BCMA-CAR T细胞通过双转导产生。我们最近报道说,将NIS掺入CAR T细胞不会损害CAR T细胞在体内的功能和功效,并允许CAR T细胞运输和扩增30。随着CAR T细胞疗法继续从目前的B细胞恶性肿瘤扩展到CLL中的应用,对允许非侵入性体内成像和?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了Mayo Clinic K2R管道(SSK),Mayo Clinic Center for Personalized Medicine(SSK)和Predolin Foundation(RS)的部分支持。图 1、2 和图 4 是使用 BioRender.com 创建的。
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |