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Cancer Research

Imaging dinamico di cellule T del recettore dell'antigene chimerico con [18F] tomografia ad emissione di positroni tetrafluoroborato/tomografia computerizzata

Published: February 17, 2022
doi:
10.3791/62334
, , , , , , , , , ,
1T Cell Engineering,Mayo Clinic, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, 3Department of Radiology,Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD,Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, 6Department of Immunology,Mayo Clinic

Summary

Questo protocollo descrive la metodologia per il tracciamento non invasivo delle cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell’antigene chimerico in vivo con una piattaforma clinicamente disponibile.

Abstract

Le cellule T geneticamente modificate per esprimere i recettori dell’antigene chimerico (CAR) hanno mostrato risultati senza precedenti in studi clinici registrativi per pazienti con tumori maligni delle cellule B o mieloma multiplo (MM). Tuttavia, numerosi ostacoli limitano l’efficacia e vietano l’uso diffuso di terapie con cellule T CAR a causa dello scarso traffico e infiltrazione nei siti tumorali e della mancanza di persistenza in vivo. Inoltre, le tossicità potenzialmente letali, come la sindrome da rilascio di citochine o la neurotossicità, sono le principali preoccupazioni. L’imaging e il tracciamento efficienti e sensibili delle cellule T CAR consentono la valutazione del traffico, dell’espansione e della caratterizzazione in vivo delle cellule T e consentono lo sviluppo di strategie per superare gli attuali limiti della terapia con cellule T CAR. Questo documento descrive la metodologia per incorporare il symporter di ioduro di sodio (NIS) nelle cellule T CAR e per l’imaging delle cellule T CAR utilizzando la tomografia ad emissione di tetrafluoroborato-positrone [18F] tetrafluoroborato ([18F] TFB-PET) in modelli preclinici. I metodi descritti in questo protocollo possono essere applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio.

Introduction

La terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico T (CAR T) è un approccio rapidamente emergente e potenzialmente curativo nelle neoplasie ematologiche1,2,3,4,5,6. Risultati clinici straordinari sono stati riportati dopo la terapia con cellule T CAR T (CART19) o CON l’antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) CAR T2. Ciò ha portato all’approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti delle cellule CART19 per il linfoma aggressivo a cellule B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblastica acuta (Tisa-Cel)5,8, linfoma a cellule del mantello (brexucabtagene autoleuce)9 e linfoma follicolare (Axi-Cel)10 . Più recentemente, la FDA ha approvato la terapia con cellule T CAR diretta da BCMA in pazienti con mieloma multiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Inoltre, la terapia con cellule T CAR per la leucemia linfocitica cronica (LLC) è in fase avanzata di sviluppo clinico e dovrebbe ricevere l’approvazione della FDA entro i prossimi tre anni1.

Nonostante i risultati senza precedenti della terapia con cellule T CAR, il suo uso diffuso è limitato da 1) insufficiente espansione in vivo delle cellule T CAR o scarso traffico verso i siti tumorali, che porta a tassi più bassi di risposta duratura12,13 e 2) lo sviluppo di eventi avversi potenzialmente letali, tra cui la sindrome da rilascio di citochine (CRS)14,15 . I segni distintivi della CRS includono non solo l’attivazione immunitaria con conseguente livelli elevati di citochine/chemochine infiammatorie, ma anche la massiccia proliferazione delle cellule T dopo infusione di cellule T CAR15,16. Pertanto, lo sviluppo di una strategia convalidata di livello clinico per l’immagine delle cellule T CAR in vivo consentirebbe 1) il tracciamento delle cellule T CAR in tempo reale in vivo per monitorare il loro traffico verso i siti tumorali e scoprire potenziali meccanismi di resistenza e 2) il monitoraggio dell’espansione delle cellule T CAR e potenzialmente prevedere le loro tossicità come lo sviluppo di CRS.

Le caratteristiche cliniche della CRS lieve sono febbre alta, affaticamento, mal di testa, eruzione cutanea, diarrea, artralgia, mialgia e malessere. Nella CRS più grave, i pazienti possono sviluppare tachicardia/ipotensione, perdita capillare, disfunzione cardiaca, insufficienza renale/epatica e coagulazione intravascolare disseminata17,18. In generale, il grado di elevazione delle citochine, tra cui interferone-gamma, fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, interleuchina (IL)-10 e IL-6, ha dimostrato di essere correlato alla gravità dei sintomi clinici17,19. Tuttavia, l’ampia applicazione del monitoraggio delle citochine sieriche “in tempo reale” per prevedere la CRS è difficile a causa dell’elevato costo e della disponibilità limitata. Per sfruttare le caratteristiche benefiche della terapia con cellule T CAR, l’imaging non invasivo delle cellule T adottive può essere potenzialmente utilizzato per prevedere l’efficacia, la tossicità e la ricaduta dopo l’infusione di cellule T CAR.

Diversi ricercatori hanno sviluppato strategie per utilizzare l’imaging a base di radionuclidi con tomografia ad emissione di positroni (PET) o tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT), che fornisce alta risoluzione e alta sensibilità20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 per il visualizzazione e monitoraggio in vivo del traffico di cellule T CAR. Tra queste strategie di imaging basate su radionuclidi, il symporter di ioduro di sodio (NIS) è stato sviluppato come modalità sensibile per l’immagine di cellule e virus utilizzando scansioni PET31,32. L’imaging delle cellule T NIS+CAR con [18F]TFB-PET è una tecnologia sensibile, efficiente e conveniente per valutare e diagnosticare l’espansione, il traffico e la tossicità delle cellule T CAR30. Questo protocollo descrive 1) lo sviluppo di cellule T NIS+CAR attraverso la doppia trasduzione ad alta efficacia e 2) una metodologia per l’imaging di cellule T NIS+CAR con scansione [18F]TFB-PET. Le cellule T BCMA-CAR per MM sono utilizzate come modello proof-of-concept per descrivere NIS come reporter per l’imaging delle cellule T CAR. Tuttavia, queste metodologie possono essere applicate a qualsiasi altra terapia con cellule T CAR.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida dell’Institutional Review Board della Mayo Clinic, del Comitato istituzionale per la biosicurezza e del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Mayo Clinic. 1. Produzione di cellule T NIS+ BCMA-CAR NOTA: Questo protocollo segue le linee guida dell’Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 17-008762) e dell’Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04). Produzione di BCMA…

Representative Results

La Figura 1 illustra le fasi di generazione delle cellule T NIS+BCMA-CAR. Il giorno 0, isolare i PBMC e quindi isolare le cellule T mediante selezione negativa. Quindi, stimolare le cellule T con perline anti-CD3 / CD28. Il giorno 1, trasdurre le cellule T con lentivirus NIS e BCMA-CAR. Nei giorni 3, 4 e 5, contare le cellule T e nutrirsi con i mezzi per regolare la concentrazione in modo che sia 1,0 × 106 / ml. Per le cellule T trasdotte da NIS, aggiungere 1 μg/mL di…

Discussion

Questo documento descrive una metodologia per incorporare NIS nelle cellule T CAR e l’imaging infuso di cellule T CAR in vivo attraverso [18F] TFB-PET. Come prova di concetto, le cellule T NIS + BCMA-CAR sono state generate tramite doppia trasduzione. Abbiamo recentemente riferito che l’incorporazione di NIS nelle cellule T CAR non compromette le funzioni e l’efficacia delle cellule T CAR in vivo e consente il traffico e l’espansione delle cellule T CAR30. P…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato in parte supportato attraverso la pipeline Mayo Clinic K2R (SSK), il Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e la Predolin Foundation (RS). Le figure 1, 2 e 4 sono state create con BioRender.com.

Materials

22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
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Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).
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