פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה למעקב לא פולשני אחר תאי T שהונדסו גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים ב- vivo עם פלטפורמה זמינה קלינית.
תאי T מהונדסים גנטית לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הראו תוצאות חסרות תקדים בניסויים קליניים מרכזיים עבור חולים עם ממאירות תאי B או מיאלומה נפוצה (MM). עם זאת, מכשולים רבים מגבילים את היעילות ואוסרים על שימוש נרחב בטיפולים בתאי CAR T עקב סחר לקוי וחדירה לאתרי גידול, כמו גם חוסר התמדה ב- vivo. יתר על כן, רעילות מסכנת חיים, כגון תסמונת שחרור ציטוקינים או רעלנות עצבית, הם חששות עיקריים. הדמיה ומעקב יעילים ורגישים של תאי CAR T מאפשרים הערכה של סחר בתאי T, הרחבה ואפיון in vivo ומאפשרים פיתוח אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנוכחיות של טיפול בתאי CAR T. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לשילוב סימפורטר הנתרן יודיד (ש”ח) בתאי CAR T ולהדמיית תאי CAR T באמצעות [18F]טטרפלואורובוראט-פוזיטרונים טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים ([18F]TFB-PET) במודלים פרה-קליניים. ניתן ליישם את השיטות המתוארות בפרוטוקול זה על מבני CAR אחרים ועל גנים ממוקדים בנוסף לאלה המשמשים למחקר זה.
טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR T) הוא גישה מתפתחת במהירות ופוטנציאלית מרפאת ממאירות המטולוגית1,2,2,3,4,5,6. תוצאות קליניות יוצאות דופן דווחו לאחר CD19 מכוון CAR T (CART19) או B התבגרות תאים אנטיגן (BCMA) CAR T טיפול בתאים2. זה הוביל לאישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) של תאי CART19 ללימפומה אגרסיבית של תאי B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, ו lisocabtagene maraleucel)7, לוקמיה לימפובלסטית חריפה (Tisa-Cel)5,8, לימפומה תאי מעטפת (brexucabtagene autoleuce)9, ולימפומה זקיקית (Axi-Cel)10 . לאחרונה, ה-FDA אישר טיפול בתאי CAR T בהכוונת BCMA בחולים עם מיאלומה נפוצה (MM) (idecabtagene vicleucel)11. יתר על כן, טיפול בתאי CAR T עבור לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) נמצא בפיתוח קליני בשלב מאוחר וצפוי לקבל את אישור ה-FDA בשלוש השנים הקרובות1.
למרות התוצאות חסרות התקדים של טיפול בתאי CAR T, השימוש הנרחב בו מוגבל על ידי 1) לא מספיק בהרחבת תאי vivo CAR T או סחר לקוי לאתרי גידולים, מה שמוביל לשיעורים נמוכים יותר של תגובה עמידה12,13 ו -2) התפתחות של תופעות לוואי מסכנות חיים, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)14,15 . סימני ההיכר של CRS כוללים לא רק הפעלה חיסונית וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים / כימותרפים, אלא גם התפשטות מסיבית של תאי T לאחר עירוי תאי CAR T15,16. לפיכך, פיתוח אסטרטגיה מאומתת ברמה קלינית לתמונה תאי CAR T ב vivo יאפשר 1) מעקב תאי CAR T בזמן אמת ב vivo כדי לפקח על הסחר שלהם לאתרי גידול ולחשוף מנגנונים פוטנציאליים של התנגדות, ו 2) ניטור של התרחבות תאי CAR T ופוטנציאל לחזות את הרעילות שלהם כגון התפתחות CRS.
תכונות קליניות של CRS מתון הן חום גבוה, עייפות, כאב ראש, פריחה, שלשולים, כאבי מפרקים, כאבי שרירים, וחולשה. ב CRS חמור יותר, חולים עלולים לפתח טכיקרדיה/תת לחץ דם, דליפת נימי, תפקוד לקוי של הלב, אי ספיקת כליות/כבד, קרישה תוך וסקולרית מופצת17,18. באופן כללי, מידת הגובה של ציטוקינים, כולל אינטרפרון-גמא, גרנולוציט-מקרופאג’ גורם מגרה מושבה, אינטרלוקין (IL)-10, ו IL-6, הוכח בקורלציה עם חומרת הסימפטומים הקליניים17,19. עם זאת, היישום הנרחב של ניטור ציטוקינים בסרום “בזמן אמת” כדי לחזות CRS קשה בשל העלות הגבוהה והזמינות המוגבלת. כדי לנצל את המאפיינים המיטיבים של טיפול בתאי CAR T, הדמיה לא פולשנית של תאי T מאמצים יכולה להיות מנוצלת באופן פוטנציאלי כדי לחזות את היעילות, הרעילות וההישנות לאחר עירוי תא CAR T.
מספר חוקרים פיתחו אסטרטגיות לשימוש בהדמיה מבוססת רדיונוקלידים עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), המספקת רזולוציה גבוהה ורגישות גבוהה20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 עבור in vivo הדמיה וניטור של סחר בתאי CAR T. בין אסטרטגיות הדמיה מבוססות רדיונוקלידים אלה, סימפורטר הנתרן יוד (NIS) פותח כמודל רגיש לתאי תמונה ווירוסים באמצעות סריקות PET31,32. הדמיית תאים NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET היא טכנולוגיה רגישה, יעילה ונוחה להערכה ואבחון של הרחבת תאי CAR T, סחר ורעילות30. פרוטוקול זה מתאר 1) פיתוח של תאי NIS+CAR T באמצעות העברה כפולה עם יעילות גבוהה ו-2) מתודולוגיה להדמיית תאי NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה. תאי BCMA-CAR T עבור MM משמשים כמודל הוכחת קונספט לתיאור NIS ככתב להדמיית תאי CAR T. עם זאת, מתודולוגיות אלה ניתן ליישם על כל טיפול בתאי CAR T אחר.
מאמר זה מתאר מתודולוגיה לשילוב ש”ח בתאי CAR T והדמיה חדורה לתאי CAR T ב-vivo באמצעות [18F]TFB-PET. כהוכחת קונספט, תאי NIS+BCMA-CAR T נוצרו באמצעות טרנסדוקציה כפולה. לאחרונה דיווחנו כי שילוב ש”ח בתאי CAR T אינו פוגע בתפקודי תאי CAR T וביעילותו ב-vivo ומאפשר סחר והרחבה של תאי CAR T30. כמו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות צינור K2R של מאיו קליניק (SSK), מרכז מרפאת מאיו לרפואה אישית (SSK) וקרן פרדילין (RS). איורים 1, 2 ו- 4 נוצרו עם BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |