يصف هذا البروتوكول منهجية تتبع الخلايا التائية غير الغازية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجسم الحي باستخدام منصة متاحة سريريا.
أظهرت الخلايا التائية المهندسة وراثيا للتعبير عن مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR) نتائج غير مسبوقة في التجارب السريرية المحورية للمرضى الذين يعانون من أورام الخلايا البائية الخبيثة أو الورم النقوي المتعدد (MM). ومع ذلك ، فإن العديد من العقبات تحد من فعالية وتحظر الاستخدام الواسع النطاق لعلاجات الخلايا التائية CAR بسبب سوء الاتجار والتسلل إلى مواقع الأورام وكذلك عدم الثبات في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن السمية التي تهدد الحياة، مثل متلازمة إطلاق السيتوكين أو السمية العصبية، هي الشواغل الرئيسية. يتيح التصوير الفعال والحساس وتتبع الخلايا التائية CAR تقييم الاتجار بالخلايا التائية وتوسيعها وتوصيف الجسم الحي ويسمح بتطوير استراتيجيات للتغلب على القيود الحالية للعلاج بالخلايا التائية CAR. تصف هذه الورقة منهجية دمج سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) في الخلايا التائية CAR والتصوير بالخلايا التائية CAR باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار [18F] رباعي فلوروبورات البوزيترون ([18F]TFB-PET) في النماذج قبل السريرية. يمكن تطبيق الطرق الموضحة في هذا البروتوكول على تركيبات CAR الأخرى والجينات المستهدفة بالإضافة إلى تلك المستخدمة في هذه الدراسة.
العلاج بالخلايا بمستقبلات المستضدات الكيميرية T (CAR T) هو نهج سريع الظهور ويحتمل أن يكون علاجيا في الأورام الخبيثة الدموية1،2،3،4،5،6. تم الإبلاغ عن نتائج سريرية غير عادية بعد العلاج بالخلايا التائية CAR T (CART19) الموجه بواسطة CD19 أو مستضد نضج الخلايا البائية (BCMA) 2. أدى ذلك إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على خلايا CART19 لسرطان الغدد الليمفاوية العدواني للخلايا البائية (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4 ، tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ، و lisocabtagene maraleucel)7 ، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (Tisa-Cel) 5,8 ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (brexucabtagene autoleuce)9 ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي (Axi-Cel)10 . في الآونة الأخيرة ، وافقت إدارة الأغذية والعقاقير على العلاج بالخلايا التائية CAR الموجهة من BCMA في المرضى الذين يعانون من الورم النقوي المتعدد (MM) (idecabtagene vicleucel)11. علاوة على ذلك ، فإن العلاج بالخلايا التائية CAR لسرطان الدم اللمفاوي المزمن (CLL) في مرحلة متأخرة من التطور السريري ومن المتوقع أن يحصل على موافقة إدارة الأغذية والعقاقير في غضون السنوات الثلاث المقبلة1.
على الرغم من النتائج غير المسبوقة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، فإن استخدامه على نطاق واسع محدود بنسبة 1) عدم كفاية توسع الخلايا التائية CAR في الجسم الحي أو سوء الاتجار إلى مواقع الورم ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الاستجابة الدائمة12،13 و 2) تطور الأحداث الضائرة التي تهدد الحياة ، بما في ذلك متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS)14،15 . السمات المميزة ل CRS لا تشمل فقط تنشيط المناعة مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة من السيتوكينات الالتهابية / chemokines ولكن أيضا انتشار الخلايا التائية الضخمة بعد ضخ الخلايا التائية CAR 15,16. وبالتالي ، فإن تطوير استراتيجية معتمدة من الدرجة السريرية لتصوير الخلايا التائية CAR في الجسم الحي سيسمح ل 1) تتبع الخلايا التائية CAR في الوقت الفعلي في الجسم الحي بمراقبة الاتجار بها إلى مواقع الأورام والكشف عن الآليات المحتملة للمقاومة ، و 2) مراقبة توسع الخلايا التائية CAR وربما التنبؤ بسميتها مثل تطور CRS.
السمات السريرية ل CRS الخفيفة هي ارتفاع درجة الحرارة والتعب والصداع والطفح الجلدي والإسهال وألم المفاصل والألم العضلي والشعور بالضيق. في CRS الأكثر شدة ، قد يصاب المرضى بعدم انتظام دقات القلب / انخفاض ضغط الدم ، وتسرب الشعيرات الدموية ، وضعف القلب ، والفشل الكلوي / الكبدي ، والتخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية 17،18. بشكل عام ، ثبت أن درجة ارتفاع السيتوكينات ، بما في ذلك الإنترفيرون غاما ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ، والإنترلوكين (IL)-10 ، و IL-6 ، ترتبط بشدة الأعراض السريرية17،19. ومع ذلك ، فإن التطبيق المكثف لمراقبة السيتوكين في المصل “في الوقت الفعلي” للتنبؤ ب CRS أمر صعب بسبب التكلفة العالية والتوافر المحدود. لاستغلال الخصائص المفيدة للعلاج بالخلايا التائية CAR ، يمكن استخدام التصوير غير الغازي للخلايا التائية بالتبني للتنبؤ بالفعالية والسمية والانتكاس بعد ضخ الخلايا التائية CAR.
طور العديد من الباحثين استراتيجيات لاستخدام التصوير القائم على النويدات المشعة مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أو التصوير المقطعي المحوسب بانبعاثات فوتون واحد (SPECT) ، والذي يوفر دقة عالية وحساسية عالية20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ل في الجسم الحي تصور ورصد الاتجار بالخلايا التائية CAR. ومن بين استراتيجيات التصوير القائمة على النويدات المشعة، تم تطوير سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) كطريقة حساسة لتصوير الخلايا والفيروسات باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني 31,32. يعد تصوير الخلايا التائية NIS+CAR باستخدام [18F]TFB-PET تقنية حساسة وفعالة ومريحة لتقييم وتشخيص توسع الخلايا التائية CAR والاتجار بها وسميتها30. يصف هذا البروتوكول 1) تطوير الخلايا التائية NIS + CAR من خلال النقل المزدوج بفعالية عالية و 2) منهجية لتصوير الخلايا التائية NIS + CAR مع [18F] TFB-PET يتم استخدام الخلايا التائية BCMA-CAR ل MM كنموذج إثبات للمفهوم لوصف NIS كمراسل لتصوير الخلايا التائية CAR. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه المنهجيات على أي علاج آخر بالخلايا التائية CAR.
تصف هذه الورقة منهجية لدمج NIS في الخلايا التائية CAR وتصوير الخلايا التائية CAR المشبعة في الجسم الحي من خلال [18F]TFB-PET. كدليل على المفهوم ، تم إنشاء الخلايا التائية NIS + BCMA-CAR عبر النقل المزدوج. لقد أبلغنا مؤخرا أن دمج NIS في الخلايا التائية CAR لا يضعف وظائف الخلايا التائية CAR وفعالي…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال خط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ومؤسسة بريدولين (RS). تم إنشاء الأشكال 1 و 2 و 4 باستخدام BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |