Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu
Summary
Bu protokol, neoplazinin çeşitli yönlerini incelemek için Drosophila tümörlerinin yetişkin konakçıların karnına ilk ve devam eden kuşak allotransplantasyonu için ayrıntılı rehberlik sağlar. Bir otoenjektör aparatı kullanarak, araştırmacılar geleneksel, manuel yöntemlerle elde edilenlere kıyasla daha iyi verimlilik ve tümör verimi elde edebilirler.
Abstract
Bu protokol, Drosophila melanogaster’deki tümörlerin oto-nanolitre enjeksiyon cihazı kullanılarak allotransplantasyonunu tanımlar. Bir otoenjektör aparatının kullanılmasıyla, eğitimli operatörler manuel enjektör kullanılarak elde edilenlere kıyasla daha verimli ve tutarlı transplantasyon sonuçları elde edebilirler. Burada, konuları kronolojik bir şekilde ele alıyoruz: Drosophila çizgilerinin geçmesinden, primer tümörün indüksiyonuna ve diseksiyonuna, primer tümörün yeni bir yetişkin konağa transplantasyonuna ve genişletilmiş çalışmalar için tümörün nesiller boyu transplantasyonuna devam edilmesine. Bir gösterim olarak, burada kuşak transplantasyonu için Notch hücre içi alan (NICD) aşırı ekspresyonuna bağlı tükürük bezi hayali halka tümörleri kullanılmaktadır. Bu tümörler ilk önce larva tükürük bezi hayali halkaları içindeki bir geçiş bölgesi mikro ortamında güvenilir bir şekilde indüklenebilir, daha sonra devam eden tümör büyümesini, evrimini ve metastazını incelemek için in vivo olarak tahsis edilebilir ve kültürlenebilir. Bu allotransplantasyon yöntemi, potansiyel ilaç tarama programlarında ve tümör-konakçı etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir.
Introduction
Bu protokol, Drosophila larva tükürük bezi (SG) hayali halka tümörlerinin bir oto-nanolitre enjeksiyon aparatı (örneğin, Nanoject) kullanılarak yetişkin konakçıların karınlarına allotransplantasyonu için adım adım rehberlik sağlar. Bu protokol aynı zamanda tümörlerin yeni nesil yetişkin konakçılara daha sonra yeniden tahsis edilmesi için talimatlar sağlar, bu da tümör evrimi ve tümör-konakçı etkileşimleri gibi tümör özelliklerinin uzunlamasına incelenmesi için fırsatlar sağlar. Protokol, ilaç tarama deneylerine de uygulanabilir.
Bu yöntem, Drosophila’da tümör allotransplantasyonunun manuel enjektörler1 kullanılarak gerçekleştirilmesinin etkinliğini artırmak için geliştirilmiştir, bu da emme ve enjeksiyon kuvvetlerinde genellikle tutarsızdır ve tümör allotransplantasyonu için optimal olmayan sonuçlara yol açmaktadır. Bir otoenjektör aparatı daha iyi kontrol sağlar ve allogreft sonrası daha düşük sinek mortalitesi oranlarına neden olabilir. Eğitimli bir operatör, manuel enjektörkullanıldığında yaklaşık% 80’e kıyasla, otomatik enjektör ile% 90’ın üzerinde bir konakçı hayatta kalma oranı elde edebilir1. Allogreft sonrası 8-12. günlerde genel tümör edinme oranı %60-80’dir. Ortalama enjeksiyon süresi ayrıca manuel bir enjektör kullanılarak sinek başına 30-40 sn’den otomatik enjektör kullanılarak sinek başına 20-25 sn’ye yükseltilmiştir.
Bu protokol, Drosophila tümör allotransplantasyonunda otoenjektör aparatını kullanan ilk birkaç protokol arasındadır. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, tümörlü nöral kök hücrelerin allotransplantasyonu için otoenjektör de kullanılmıştır2. Daha önce, otoenjektör aparatı Drosophila’da bakteriyel virülans3, paraziter enfeksiyonlar ve konakçı savunması4’ü incelemek ve farklı bileşiklerin biyoaktivitesini taramak için kullanıldı5. Protokolümüz, otoenjektör aparatını tümör enjeksiyonu kullanımı için uyarlar ve Drosophila araştırmacılarına daha yüksek kaliteli ve daha tutarlı sonuçlar sunarken onlara önemli ölçüde zaman kazandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol sadece tümörlerin allotransplantasyonu için kullanılamaz, aynı zamanda benzer kalibre6’daki wildtype ve mutant dokuların allotransplantasyonuna da uyarlanabilir.
Bu protokolde kullanılan Drosophila NICD tümörü ilk olarak Yang ve ark.7 tarafından SG hayali halka geçiş bölgesinde, yüksek seviyelerde endojen Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörleri (JAK-STAT) ve c-Jun N-terminal Kinaz (JNK) aktivitesi sergileyen bir “tümör sıcak noktası” nda tanıtıldı. Ek olarak, geçiş bölgesi yüksek seviyelerde matriks metalloproteinaz-1 (MMP1)7’ye sahiptir, bu da bu bölgeyi özellikle tümörigeneze elverişli kılar. NICD aşırı ekspresyonu yoluyla çentik yolu aktivasyonu tek başına tümör oluşumunu sürekli olarak başlatmak için yeterlidir. Bu tümörler daha sonra tümör hücresi bölünmesi, invazyonu ve tümör-konakçı etkileşimleri dahil olmak üzere çok çeşitli konuların araştırılmasına izin vermek için tahsis edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör allotransplantasyonu, araştırmacıların Drosophila tümörünün büyümesi ve ilerlemesi sırasında ortaya çıkan bazı sorunları ele almalarına yardımcı olabilir. Böyle bir zorluk, primer tümör kültürü 12 sırasında tümör taşıyan larvaların veya yetişkinlerin erken ölümlerininatlatılmasıdır. Bu bağlamda, devam eden tümör allotransplantasyonu, tümörlerin süresiz olarak büyümesine izin verir, bu da tümör büyümesi, metastazı ve evriminin uzun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eski laboratuvar üyeleri Dr. Sheng-An Yang ve Bay Juan-Martin Portilla’ya bu protokolün geliştirilmesindeki katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Dr. Yan Song’un Pekin Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi’ndeki laboratuvarına, manuel allotransplantasyon konusundaki protokollerini paylaştıkları için minnettarız. Ayrıca Bay Calder Ellsworth ve Bay Everest Shapiro’ya el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz.
KİS’ler bu çalışma için Ulusal Sağlık Enstitüsü’nden (https://www.nih.gov/) fon (GM072562, CA224381, CA227789) ve Ulusal Bilim Vakfı’ndan (htps://nsf.gov/) finansman (IOS-155790) aldı. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
