אלוטרנספלנטציה של גידול בדרוזופילה מלנוגסטר עם מזרק אוטו-ננולטר הניתן לתכנות
Summary
פרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת להקצאה הדורית הראשונית והמתמשכת של גידולי דרוזופילה לתוך בטנם של מארחים בוגרים לחקר היבטים שונים של ניאופלזיה. באמצעות מנגנון autoinjector, חוקרים יכולים להשיג יעילות משופרת ותפוקת הגידול בהשוואה לאלה שהושגו על ידי שיטות מסורתיות, ידניות.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את ההקצאה של גידולים ב – Drosophila melanogaster באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי. עם השימוש במנגנון autoinjector, מפעילים מיומנים יכולים להשיג תוצאות השתלה יעילות ועקביות יותר בהשוואה לאלה המתקבלות באמצעות מזרק ידני. כאן אנו מכסים נושאים בצורה כרונולוגית: החל מחציית קווי דרוזופילה , דרך אינדוקציה ונתיחה של הגידול הראשוני, השתלת הגידול הראשוני לפונדקאי בוגר חדש והמשך השתלה דורית של הגידול למחקרים ממושכים. כהדגמה, כאן אנו משתמשים בתחום התוך-תאי של Notch (NICD) בביטוי יתר המושרה על ידי גידולי טבעת הרוק המושרים על ידי בלוטת הרוק לצורך השתלה דורית. גידולים אלה יכולים תחילה להיות מושרים באופן אמין במיקרו-סביבה של אזור מעבר בתוך טבעות דמיוניות של בלוטת הרוק הזחלית, ולאחר מכן להשתיל אותם ולתרבת אותם in vivo כדי לחקור את המשך גדילת הגידול, האבולוציה והגרורות. שיטת ההקצאה הזו יכולה להיות שימושית בתוכניות בדיקת תרופות פוטנציאליות, כמו גם לחקר אינטראקציות בין גידול למארח.
Introduction
פרוטוקול זה מספק הנחיה שלב אחר שלב להקצאה של גידולים דמיוניים של בלוטת הרוק הזחלית של דרוזופילה (SG) לתוך הבטן של מארחים בוגרים באמצעות מנגנון הזרקה אוטו-ננוליטי (למשל, Nanoject). פרוטוקול זה מספק גם כיוונים להשתלה מחדש של גידולים לדורות חדשים של מארחים בוגרים, מה שמספק הזדמנויות להמשך מחקר אורך של מאפייני הגידול, כגון אבולוציה של גידולים ואינטראקציות בין גידולים לפונדקאים. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על ניסויים בסינון תרופות.
שיטה זו פותחה כדי לשפר את היעילות של ביצוע allotransplantation הגידול ב Drosophila באמצעות מזרקים ידניים1, אשר לעתים קרובות אינם עקביים בכוחות היניקה וההזרקה שלהם, מה שמוביל לתוצאות לא אופטימליות עבור allotransplantation הגידול. מנגנון אוטו-איניג’קטור מספק שליטה טובה יותר ויכול לגרום לשיעורים נמוכים יותר של תמותת זבובים לאחר אלוגרפט. מפעיל מיומן יכול להשיג שיעור הישרדות של יותר מ-90% עם המזרק האוטומטי, לעומת כ-80% כאשר נעשה שימוש במזרק הידני1. שיעור רכישת הגידול הכולל הוא 60%-80% ביום 8-12 לאחר הלידה. זמן ההזרקה הממוצע השתפר גם הוא מ-30-40 שניות לטוס באמצעות מזרק ידני ל-20-25 שניות לטוס באמצעות האוטו-איניג’קטור.
פרוטוקול זה הוא בין הפרוטוקולים הראשונים שהשתמשו במנגנון האוטו-איניג’קטור באלוטרנספלנטציה של גידול דרוזופילה . מחקר שנערך לאחרונה השתמש גם ב-autoinjector עבור ההקצאה של תאי גזע עצביים סרטניים2. בעבר, מנגנון autoinjector שימש Drosophila כדי לחקור ויראליות חיידקית3, זיהומים טפיליים והגנה המארח4, כמו גם הקרנה עבור פעילות ביולוגית של תרכובות שונות5. הפרוטוקול שלנו מתאים את מנגנון ה-autoinjector לשימוש בהזרקת גידולים ומבקש לספק לחוקרי Drosophila תוצאות איכותיות ועקביות יותר תוך חיסכון בזמן רב. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק עבור allotransplantation של גידולים, אלא יכול להיות מותאם גם אלוטרנספלנטציה של wildtype ורקמות מוטנטיות של קליבר דומה6.
גידול ה-Drosophila NICD המשמש בפרוטוקול זה הוצג לראשונה על ידי Yang et al.7 באזור המעבר של הטבעת הדמיונית SG, “נקודה חמה של גידול” המציג רמות גבוהות של מתמר ג’אנוס קינאז/אותות אנדוגניים ומפעילי שעתוק (JAK-STAT), ופעילות c-Jun N-terminal Kinase (JNK). בנוסף, באזור המעבר יש רמות גבוהות של מטריצה metalloproteinase-1 (MMP1)7, מה שהופך את האזור הזה לתרום במיוחד לגידולים סרטניים. הפעלת מסלול חריץ באמצעות ביטוי יתר של NICD בלבד מספיקה כדי ליזום באופן עקבי היווצרות גידולים. לאחר מכן ניתן להקצות גידולים אלה כדי לאפשר חקירה של מגוון רחב של נושאים, כולל חלוקת תאי גידול, פלישה ואינטראקציות בין גידול לפונדקאי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אלוטרנסנטציה של גידולים יכולה לסייע לחוקרים לטפל בבעיות מסוימות המתעוררות במהלך גדילת הגידול בהתקדמותו של דרוזופילה. אתגר אחד כזה הוא עקיפת מקרי מוות בטרם עת של זחלים נושאי גידול או מבוגרים במהלך תרבית גידול ראשונית12. בהקשר זה, המשך ההקצאה של הגידול מאפשר לגידולים לגדו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה לשעבר ד”ר שנג-אן יאנג ולמר חואן-מרטין פורטייה על תרומתם בפיתוח פרוטוקול זה. אנו אסירי תודה למעבדתו של ד”ר יאן סונג בבית הספר למדעי החיים של אוניברסיטת פקין על שיתוף הפרוטוקול שלהם בנושא הקצאה ידנית. אנו מודים גם למר קאלדר אלסוורת’ ולמר אוורסט שפירו על הקריאה הביקורתית בכתב היד.
נשק להשמדה המונית קיבל מימון (GM072562, CA224381, CA227789) עבור עבודה זו מהמכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/) ומימון (IOS-155790) מהקרן הלאומית למדע (htps://nsf.gov/). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, באיסוף וניתוח הנתונים, בהחלטה על פרסום או בהכנת כתב היד.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
