프로그래밍 가능한 자동 나노리터 인젝터 를 사용한 초파리 멜라노가스터 에서의 종양 동종이식
Summary
이 프로토콜은 신생물의 다양한 측면을 연구하기 위해 초 파리 종양을 성인 숙주의 복부로 초기 및 지속적인 세대 동종 이식에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 자동 인젝터 장치를 사용하여 연구원은 기존의 수동 방법에 의해 달성 된 것과 비교하여 향상된 효율과 종양 수율을 달성 할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치를 사용하는 초파리 멜라노가스터 에서 종양의 동종이식을 기술한다. 자동 인젝터 장치를 사용하면 숙련 된 작업자가 수동 인젝터를 사용하여 얻은 것보다 더 효율적이고 일관된 이식 결과를 얻을 수 있습니다. 여기에서, 우리는 연대순으로 주제를 다룹니다 : 초파리 선의 교차에서부터 원발성 종양의 유도 및 해부, 원발성 종양을 새로운 성인 숙주로 이식하고 확장 된 연구를 위해 종양의 지속적인 세대 이식에 이르기까지. 실증으로서, 여기서 우리는 세대 이식을 위해 노치 세포내 도메인 (NICD) 과발현 유도 타액선 상상 고리 종양을 사용한다. 이들 종양은 먼저 유충 타액선 상상 고리 내의 전이 구역 미세환경에서 확실하게 유도될 수 있고, 이어서 동종이식편되고 생체내에서 배양되어 지속적인 종양 성장, 진화 및 전이를 연구할 수 있다. 이러한 동종이식 방법은 잠재적인 약물 스크리닝 프로그램뿐만 아니라 종양-숙주 상호작용을 연구하는데 유용할 수 있다.
Introduction
이 프로토콜은 자동 나노리터 주사 장치(예를 들어, Nanoject)를 사용하여 초파리 유충 타액선(SG) 상상 고리 종양을 성인 숙주의 복부 내로의 동종이식을 위한 단계별 지침을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 새로운 세대의 성인 숙주로의 종양의 후속 재동종이식편에 대한 지침을 제공하며, 이는 종양 진화 및 종양-숙주 상호작용과 같은 종양 특성에 대한 지속적인 종단 연구를 위한 기회를 제공한다. 이 프로토콜은 또한 약물 스크리닝 실험에 적용될 수 있다.
이 방법은 수동 인젝터1을 사용하여 초파리에서 종양 동종 이식을 수행하는 효능을 향상시키기 위해 개발되었으며, 이는 종종 흡입 및 주사력에 일관성이 없어 종양 동종 이식에 대한 차선책의 결과를 초래합니다. 자동 인젝터 장치는 더 나은 제어를 제공하며 동종 이식 후 파리 사망률을 낮출 수 있습니다. 훈련된 작업자는 수동 인젝터를 사용했을 때 약 80%에 비해 자동 인젝터로 90% 이상의 호스트 생존율을 달성할 수 있었습니다1. 전체 종양 획득률은 동종이식편 후 8-12일째에 60%-80%이다. 평균 주입 시간도 수동 인젝터를 사용하여 비행 당 30-40 초에서 자동 인젝터를 사용하여 비행 당 20-25 초로 향상되었습니다.
이 프로토콜은 초파리 종양 동종 이식에서 자동 주입기 장치를 사용하는 처음 몇 가지 프로토콜 중 하나입니다. 최근의 한 연구는 또한 종양성 신경 줄기 세포의 동종이식을 위해 자가주입기를 사용하였다2. 이전에, 자가 인젝터 장치는 초파리 에서 박테리아 독성3, 기생충 감염 및 숙주 방어4를 연구하고 다른 화합물5의 생체 활성을 스크리닝하기 위해 사용되었습니다. 우리의 프로토콜은 종양 주사 사용을 위해 자동 인젝터 장치를 적응시키고 Drosophila 연구원에게 상당한 시간을 절약하면서 더 높은 품질과 일관된 결과를 제공하고자합니다. 이 프로토콜은 종양의 동종 이식에 사용될 수있을뿐만 아니라 유사한 구경6의 야생형 및 돌연변이 조직의 동종 이식에도 적합 할 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용 된 초파리 NICD 종양은 SG 상상 고리 전이 구역, 높은 수준의 내인성 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 활성제 (JAK-STAT) 및 c-Jun N 말단 키나아제 (JNK) 활성을 나타내는 “종양 핫스팟”에서 Yang et al.7 에 의해 처음 도입되었습니다. 추가적으로, 전이 영역은 높은 수준의 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP1)7을 가지며, 이는 이 영역을 특히 종양 발생에 도움이 되게 한다. NICD 과발현 단독을 통한 노치 경로 활성화는 종양 형성을 일관되게 개시하기에 충분하다. 이들 종양은 종양 세포 분열, 침윤 및 종양-숙주 상호작용을 포함하는 광범위한 주제의 조사를 허용하기 위해 후속적으로 동종이식될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양 동종 이식은 연구자가 초파리 종양 성장 및 진행 중에 발생하는 특정 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러한 도전 중 하나는 원발성 종양 배양12 동안 종양을 가진 유충 또는 성인의 조기 사망을 우회하는 것입니다. 이러한 맥락에서, 지속적인 종양 동종이식은 종양이 무기한으로 성장할 수 있게 하여, 종양 성장, 전이 및 진화에 대한 종단 연구를 용이하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전 실험실 구성원 인 Sheng-An Yang 박사와 Juan-Martin Portilla 씨가이 프로토콜을 개발하는 데 기여한 것에 대해 감사드립니다. 북경 대학 생명 과학 대학원의 Yan Song 박사의 실험실에서 수동 동종 이식에 대한 프로토콜을 공유 한 것에 감사드립니다. 우리는 또한 Calder Ellsworth와 Everest Shapiro 씨가 원고를 비판적으로 읽어 주신 것에 감사드립니다.
WMD는 국립 보건원 (https://www.nih.gov/)으로부터이 작업에 대한 자금 (GM072562, CA224381, CA227789)과 국립 과학 재단 (htps://nsf.gov/)으로부터 자금 (IOS-155790)을 받았다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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