Аллотрансплантация опухоли у Drosophila melanogaster с программируемым авто-нанолитрным инъектором
Summary
Этот протокол предоставляет подробное руководство для начальной и продолжающейся аллотрансплантации опухолей дрозофилы в брюшную полость взрослых хозяев для изучения различных аспектов неоплазии. Используя аутоинжекторный аппарат, исследователи могут достичь улучшенной эффективности и выхода опухоли по сравнению с теми, которые достигаются традиционными, ручными методами.
Abstract
Этот протокол описывает аллотрансплантацию опухолей у Drosophila melanogaster с использованием автомата нанолитра инъекционного аппарата. С помощью автоинжекторного аппарата обученные операторы могут достичь более эффективных и последовательных результатов трансплантации по сравнению с теми, которые получены с использованием ручного инъектора. Здесь мы освещаем темы в хронологическом порядке: от пересечения линий дрозофилы до индукции и рассечения первичной опухоли, трансплантации первичной опухоли новому взрослому хозяину и продолжающейся трансплантации опухоли для расширенных исследований. В качестве демонстрации здесь мы используем внутриклеточный домен Notch (NICD), индуцированную сверхэкспрессией слюнных желез имагинальных кольцевых опухолей для трансплантации поколений. Эти опухоли могут быть сначала надежно индуцированы в микроокружении переходной зоны в воображаемых кольцах личиночной слюнной железы, а затем аллотрансплантированы и культивированы in vivo для изучения продолжающегося роста, эволюции и метастазирования опухоли. Этот метод аллотрансплантации может быть полезен в потенциальных программах скрининга лекарств, а также для изучения взаимодействий опухоли и хозяина.
Introduction
Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство по аллотрансплантации опухолей имагинального кольца личиночной слюнной железы Drosophila (SG) в брюшную полость взрослых хозяев с использованием аппарата для инъекции автонанолитров (например, Nanoject). Этот протокол также предоставляет направления для последующей реаллотрансплантации опухолей в новые поколения взрослых хозяев, что обеспечивает возможности для продолжения продольного изучения характеристик опухоли, таких как эволюция опухоли и взаимодействия опухоли с хозяином. Протокол также может быть применен к экспериментам по скринингу лекарств.
Этот метод был разработан для повышения эффективности выполнения аллотрансплантации опухоли при дрозофиле с использованием ручных инъекторов1, которые часто непоследовательны в своих силах всасывания и инъекции, что приводит к неоптимальным результатам для аллотрансплантации опухоли. Автоинжекторный аппарат обеспечивает лучший контроль и может привести к более низким показателям смертности мух после аллотрансплантата. Обученный оператор мог достичь выживаемости хозяина более 90% с автоинжектором, по сравнению с примерно 80%, когда использовался ручной инжектор1. Общая скорость приобретения опухоли составляет 60%-80% на 8-12 день после аллотрансплантата. Среднее время впрыска также было улучшено с 30-40 с на муху при использовании ручного инжектора до 20-25 с на муху с использованием автоинжектора.
Этот протокол является одним из первых нескольких протоколов для использования аутоинъекторного аппарата при аллотрансплантации опухоли дрозофилы . В недавнем исследовании также использовался аутоинъектор для аллотрансплантации опухолевых нервных стволовых клеток2. Ранее аутоинжекторный аппарат применялся у дрозофилы для изучения бактериальной вирулентности3, паразитарных инфекций и защиты хозяина4, а также скрининга на биоактивность различных соединений5. Наш протокол адаптирует аутоинжекторный аппарат для инъекций опухоли и стремится предоставить исследователям дрозофилы более высокое качество и более последовательные результаты, экономя при этом их значительное время. Этот протокол может быть не только использован для аллотрансплантации опухолей, но также может быть адаптирован к аллотрансплантации диких типов и мутантных тканей аналогичного калибра6.
Опухоль Drosophila NICD, используемая в этом протоколе, была впервые введена Yang et al.7 в переходную зону имагинального кольца SG, «опухолевую горячую точку», которая демонстрирует высокие уровни эндогенной янус-киназы / сигнального преобразователя и активаторов транскрипции (JAK-STAT) и активности c-Jun N-терминальной киназы (JNK). Кроме того, переходная зона имеет высокие уровни матриксной металлопротеиназы-1 (MMP1)7, что делает эту область особенно благоприятной для опухолевого генеза. Активация пути Notch только через сверхэкспрессию NICD достаточна для последовательного инициирования образования опухоли. Эти опухоли могут быть впоследствии аллотрансплантированы, чтобы позволить исследовать широкий спектр тем, включая деление опухолевых клеток, инвазию и взаимодействие опухоли с хозяином.
Protocol
Representative Results
Discussion
Аллотрансплантация опухоли может помочь исследователям решить определенные проблемы, возникающие во время роста и прогрессирования опухоли дрозофилы. Одной из таких проблем является обход преждевременной смерти опухоленосных личинок или взрослых особей во время первичной опу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим бывших членов лаборатории д-ра Шэн-Ан Яна и г-на Хуана-Мартина Портилью за их вклад в разработку этого протокола. Мы благодарны лаборатории доктора Яна Сонга в Школе наук о жизни Пекинского университета за то, что она поделилась своим протоколом ручной аллотрансплантации. Мы также благодарим г-на Колдера Эллсворта и г-на Эвереста Шапиро за критическое прочтение рукописи.
ОМУ получил финансирование (GM072562, CA224381, CA227789) для этой работы от Национального института здравоохранения (https://www.nih.gov/) и финансирование (IOS-155790) от Национального научного фонда (htps://nsf.gov/). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
