Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector
Summary
Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de initiële en voortgezette generatie allotransplantatie van Drosophila-tumoren in de buik van volwassen gastheren voor het bestuderen van verschillende aspecten van neoplasie. Met behulp van een auto-injectorapparaat kunnen onderzoekers verbeterde efficiëntie en tumoropbrengsten bereiken in vergelijking met die bereikt door traditionele, handmatige methoden.
Abstract
Dit protocol beschrijft de allotransplantatie van tumoren in Drosophila melanogaster met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat. Met het gebruik van een autoinjectorapparaat kunnen getrainde operators efficiëntere en consistentere transplantatieresultaten bereiken in vergelijking met die verkregen met behulp van een handmatige injector. Hier behandelen we onderwerpen op een chronologische manier: van het kruisen van Drosophila-lijnen tot de inductie en dissectie van de primaire tumor, transplantatie van de primaire tumor in een nieuwe volwassen gastheer en voortgezette generatietransplantatie van de tumor voor uitgebreide studies. Als demonstratie gebruiken we hier Notch intracellulair domein (NICD) overexpressie geïnduceerde speekselklier imaginaire ringtumoren voor generatietransplantatie. Deze tumoren kunnen eerst betrouwbaar worden geïnduceerd in een micro-omgeving van de overgangszone binnen larvale speekselklier imaginaire ringen, vervolgens allografeerd en gekweekt in vivo om verdere tumorgroei, evolutie en metastase te bestuderen. Deze allotransplantatiemethode kan nuttig zijn in potentiële screeningsprogramma’s voor geneesmiddelen, evenals voor het bestuderen van tumor-gastheerinteracties.
Introduction
Dit protocol biedt een stapsgewijze begeleiding voor allotransplantatie van Drosophila larvale speekselklier (SG) imaginaire ringtumoren in buiken van volwassen gastheren met behulp van een auto-nanoliter injectieapparaat (bijv. Nanoject). Dit protocol geeft ook aanwijzingen voor de daaropvolgende re-allografatie van tumoren in nieuwe generaties volwassen gastheren, wat mogelijkheden biedt voor voortdurende longitudinale studie van tumorkenmerken, zoals tumorevolutie en tumor-gastheerinteracties. Het protocol kan ook worden toegepast op experimenten met het screenen van geneesmiddelen.
Deze methode is ontwikkeld om de werkzaamheid van het uitvoeren van tumor allotransplantatie in Drosophila te verbeteren met behulp van handmatige injectoren1, die vaak inconsistent zijn in hun zuig- en injectiekrachten, wat leidt tot suboptimale resultaten voor tumor allotransplantatie. Een autoinjectorapparaat zorgt voor een betere controle en kan resulteren in lagere vliegsterfte na allograft. Een getrainde operator kon een gastheeroverleving van meer dan 90% bereiken met de autoinjector, vergeleken met ongeveer 80% wanneer de handmatige injector werd gebruikt1. Het totale tumoracquisitiepercentage is 60% -80% op dag 8-12 post-allograft. De gemiddelde injectietijd is ook verbeterd van 30-40 s per vlieg met behulp van een handmatige injector tot 20-25 s per vlieg met behulp van de autoinjector.
Dit protocol is een van de eerste protocollen om het autoinjectorapparaat te gebruiken bij Drosophila tumor allotransplantatie. Een recente studie gebruikte ook de autoinjector voor allotransplantatie van tumorachtige neurale stamcellen2. Eerder werd het autoinjectorapparaat gebruikt in Drosophila om bacteriële virulentie3, parasitaire infecties en gastheerverdediging4 te bestuderen, evenals screening op bioactiviteit van verschillende verbindingen5. Ons protocol past het autoinjectorapparaat aan voor het gebruik van tumorinjecties en probeert Drosophila-onderzoekers een hogere kwaliteit en consistentere resultaten te bieden, terwijl ze veel tijd besparen. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor de allotransplantatie van tumoren, maar kan ook worden afgestemd op de allotransplantatie van wildtype en mutante weefsels van vergelijkbaar kaliber6.
De Drosophila NICD-tumor die in dit protocol wordt gebruikt, werd voor het eerst geïntroduceerd door Yang et al.7 in de SG imaginaire ringovergangszone, een “tumorhotspot” die hoge niveaus van endogene Janus Kinase / Signaaltransducer en Activators van Transcriptie (JAK-STAT) vertoont, en c-Jun N-terminal Kinase (JNK) activiteit. Bovendien heeft de overgangszone hoge niveaus van matrix metalloproteinase-1 (MMP1)7, waardoor dit gebied bijzonder bevorderlijk is voor tumorigenese. Notch pathway activatie door NICD overexpressie alleen is voldoende om consequent tumorvorming te initiëren. Deze tumoren kunnen vervolgens worden allotransplanteerd om onderzoek van een breed scala aan onderwerpen mogelijk te maken, waaronder tumorceldeling, invasie en tumor-gastheerinteracties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor allotransplantatie kan onderzoekers helpen bij het aanpakken van bepaalde problemen die zich voordoen tijdens de groei en progressie van Drosophila-tumoren. Een van die uitdagingen is het omzeilen van voortijdige sterfgevallen van tumordragende larven of volwassenen tijdens primaire tumorkweek12. In deze context zorgt voortdurende tumorallotransplantatie ervoor dat tumoren voor onbepaalde tijd kunnen groeien, wat longitudinale studies van tumorgroei, metastase en evolutie vergemakke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de voormalige lableden Dr. Sheng-An Yang en de heer Juan-Martin Portilla voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van dit protocol. We zijn dankbaar voor het laboratorium van Dr. Yan Song aan de Peking University School of Life Sciences voor het delen van hun protocol over handmatige allotransplantatie. We bedanken ook de heer Calder Ellsworth en de heer Everest Shapiro voor het kritisch lezen van het manuscript.
WMD ontving financiering (GM072562, CA224381, CA227789) voor dit werk van het National Institute of Health (https://www.nih.gov/) en financiering (IOS-155790) van de National Science Foundation (htps://nsf.gov/). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, gegevensverzameling en -analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
