Tumorallotransplantation in Drosophila melanogaster mit einem programmierbaren Auto-Nanoliter-Injektor
Summary
Dieses Protokoll bietet detaillierte Anleitungen für die anfängliche und fortgesetzte Allotransplantation von Drosophila-Tumoren in den Bauch erwachsener Wirte zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Neoplasie. Mit einem Autoinjektor-Gerät können Forscher eine verbesserte Effizienz und Tumorausbeute im Vergleich zu herkömmlichen, manuellen Methoden erzielen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Allotransplantation von Tumoren in Drosophila melanogaster unter Verwendung eines Auto-Nanoliter-Injektionsapparates. Mit dem Einsatz eines Autoinjektor-Geräts können geschulte Bediener effizientere und konsistentere Transplantationsergebnisse erzielen als mit einem manuellen Injektor. Hier behandeln wir Themen in chronologischer Weise: von der Kreuzung der Drosophila-Linien über die Induktion und Dissektion des Primärtumors, die Transplantation des Primärtumors in einen neuen erwachsenen Wirt bis hin zur fortgesetzten Generationentransplantation des Tumors für erweiterte Studien. Als Demonstration verwenden wir hier Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary doil imaginal ring tumors for generational transplantation. Diese Tumoren können zunächst zuverlässig in einer Übergangszonen-Mikroumgebung innerhalb von Larven-Speicheldrüsen-imaginären Ringen induziert und dann in vivo allotransplantiert und kultiviert werden, um das kontinuierliche Tumorwachstum, die Evolution und die Metastasierung zu untersuchen. Diese Allotransplantationsmethode kann in potenziellen Arzneimittel-Screening-Programmen sowie zur Untersuchung von Tumor-Wirt-Wechselwirkungen nützlich sein.
Introduction
Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Allotransplantation von imaginären Ringtumoren der Drosophila-Larvenspeicheldrüse (SG) in den Bauch erwachsener Wirte unter Verwendung eines Auto-Nanoliter-Injektionsapparats (z. B. Nanoject). Dieses Protokoll liefert auch Anweisungen für die anschließende Reallograftierung von Tumoren in neue Generationen von erwachsenen Wirten, was Möglichkeiten für eine fortgesetzte Längsschnittuntersuchung von Tumormerkmalen wie Tumorevolution und Tumor-Wirt-Interaktionen bietet. Das Protokoll kann auch auf Arzneimittel-Screening-Experimente angewendet werden.
Diese Methode wurde entwickelt, um die Wirksamkeit der Durchführung einer Tumorallotransplantation bei Drosophila unter Verwendung manueller Injektoren1 zu verbessern, die in ihren Saug- und Injektionskräften oft inkonsistent sind, was zu suboptimalen Ergebnissen für die Tumorallotransplantation führt. Ein Autoinjektor-Apparat bietet eine bessere Kontrolle und kann zu niedrigeren Raten der Fliegensterblichkeit nach dem Allotransplantat führen. Ein geschulter Bediener konnte mit dem Autoinjektor eine Wirtsüberlebensrate von über 90% erreichen, verglichen mit etwa 80%, wenn der manuelle Injektor verwendetwurde 1. Die Gesamttumorakquisitionsrate beträgt 60% -80% am Tag 8-12 nach dem Allotransplantat. Die durchschnittliche Injektionszeit wurde ebenfalls von 30-40 s pro Fliege mit einem manuellen Injektor auf 20-25 s pro Fliege mit dem Autoinjektor verbessert.
Dieses Protokoll gehört zu den ersten Protokollen, die den Autoinjektorapparat bei der Drosophila-Tumorallotransplantation verwenden. Eine kürzlich durchgeführte Studie verwendete den Autoinjektor auch für die Allotransplantation von tumorösen neuralen Stammzellen2. Zuvor wurde der Autoinjektorapparat in Drosophila verwendet, um die bakterielle Virulenz3, parasitäre Infektionen und die Wirtsabwehr4 sowie das Screening auf Bioaktivität verschiedener Verbindungen5 zu untersuchen. Unser Protokoll passt den Autoinjektorapparat für die Verwendung von Tumorinjektionen an und versucht, Drosophila-Forschern eine höhere Qualität und konsistentere Ergebnisse zu liefern und ihnen gleichzeitig viel Zeit zu sparen. Dieses Protokoll kann nicht nur für die Allotransplantation von Tumoren verwendet werden, sondern kann auch auf die Allotransplantation von Wildtyp- und mutiertem Gewebe ähnlichen Kalibers6 zugeschnitten werden.
Der in diesem Protokoll verwendete Drosophila NICD-Tumor wurde erstmals von Yang et al.7 in der SG-Übergangszone des imaginären Rings eingeführt, einem “Tumor-Hotspot”, der hohe Konzentrationen an endogener Januskinase / Signalwandler und Aktivatoren der Transkription (JAK-STAT) und c-Jun N-terminaler Kinase (JNK) -Aktivität aufweist. Darüber hinaus weist die Übergangszone einen hohen Gehalt an Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1)7 auf, was diese Region besonders förderlich für die Tumorgenese macht. Die Aktivierung des Notch-Signalwegs durch NICD-Überexpression allein reicht aus, um die Tumorbildung konsequent einzuleiten. Diese Tumoren können anschließend allotransplantiert werden, um eine breite Palette von Themen zu untersuchen, einschließlich Tumorzellteilung, Invasion und Tumor-Wirt-Interaktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Tumorallotransplantation kann Forschern helfen, bestimmte Probleme anzugehen, die während des Wachstums und der Progression von Drosophila-Tumoren auftreten. Eine dieser Herausforderungen ist die Umgehung des vorzeitigen Todes von tumortragenden Larven oder Erwachsenen während der primären Tumorkultur12. In diesem Zusammenhang ermöglicht die fortgesetzte Tumorallotransplantation das unbegrenzte Wachstum von Tumoren, was Längsschnittstudien des Tumorwachstums, der Metastasierung u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den ehemaligen Labormitgliedern Dr. Sheng-An Yang und Juan-Martin Portilla für ihren Beitrag bei der Entwicklung dieses Protokolls. Wir sind dem Labor von Dr. Yan Song an der Peking University School of Life Sciences dankbar, dass es sein Protokoll zur manuellen Allotransplantation weitergegeben hat. Wir danken auch Herrn Calder Ellsworth und Herrn Everest Shapiro für die kritische Lektüre des Manuskripts.
WMD erhielt für diese Arbeit eine Finanzierung (GM072562, CA224381, CA227789) vom National Institute of Health (https://www.nih.gov/) und eine Finanzierung (IOS-155790) von der National Science Foundation (htps://nsf.gov/). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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