Allotrapianto tumorale in Drosophila melanogaster con iniettore auto-nanolitro programmabile
Summary
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata per l’allotrapianto generazionale iniziale e continuo di tumori della Drosophila nell’addome di ospiti adulti per lo studio di vari aspetti della neoplasia. Utilizzando un apparato autoiniettore, i ricercatori possono ottenere una migliore efficienza e resa tumorale rispetto a quelli ottenuti con metodi manuali tradizionali.
Abstract
Questo protocollo descrive l’allotrapianto di tumori in Drosophila melanogaster utilizzando un apparato di iniezione auto-nanolitro. Con l’uso di un apparato autoiniettore, gli operatori addestrati possono ottenere risultati di trapianto più efficienti e coerenti rispetto a quelli ottenuti utilizzando un iniettore manuale. Qui, copriamo gli argomenti in modo cronologico: dall’incrocio delle linee di Drosophila , all’induzione e dissezione del tumore primario, al trapianto del tumore primario in un nuovo ospite adulto e al trapianto generazionale continuato del tumore per studi estesi. Come dimostrazione, qui usiamo i tumori ad anello immaginale indotti dalla sovraespressione della ghiandola salivare indotti dal dominio intracellulare di Notch (NICD) per il trapianto generazionale. Questi tumori possono prima essere indotti in modo affidabile in un microambiente della zona di transizione all’interno degli anelli immaginali della ghiandola salivare larvale, quindi allografati e coltivati in vivo per studiare la continua crescita, l’evoluzione e le metastasi del tumore. Questo metodo di allotrapianto può essere utile in potenziali programmi di screening farmacologico, nonché per lo studio delle interazioni tumore-ospite.
Introduction
Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per l’allotrapianto di tumori dell’anello immaginale della ghiandola salivare larvale (SG) di Drosophila negli addominali di ospiti adulti utilizzando un apparato di iniezione di auto-nanoliti (ad esempio, Nanoject). Questo protocollo fornisce anche indicazioni per la successiva ri-allocuzione dei tumori in nuove generazioni di ospiti adulti, che offre opportunità per uno studio longitudinale continuo delle caratteristiche del tumore, come l’evoluzione del tumore e le interazioni tumore-ospite. Il protocollo può anche essere applicato a esperimenti di screening dei farmaci.
Questo metodo è stato sviluppato per migliorare l’efficacia dell’esecuzione dell’allotrapianto tumorale in Drosophila utilizzando iniettori manuali1, che sono spesso incoerenti nelle loro forze di aspirazione e iniezione, portando a risultati non ottimali per l’allotrapianto tumorale. Un apparato autoiniettore fornisce un migliore controllo e può comportare tassi più bassi di mortalità delle mosche dopo l’allotrapianto. Un operatore addestrato potrebbe raggiungere un tasso di sopravvivenza dell’ospite di oltre il 90% con l’autoiniettore, rispetto a circa l’80% quando è stato utilizzato l’iniettore manuale1. Il tasso complessivo di acquisizione del tumore è del 60%-80% al giorno 8-12 post-allotrapianto. Anche il tempo medio di iniezione è stato migliorato da 30-40 s per mosca utilizzando un iniettore manuale a 20-25 s per mosca utilizzando l’autoiniettore.
Questo protocollo è tra i primi protocolli ad utilizzare l’apparato autoiniettore nell’allotrapianto del tumore Drosophila . Un recente studio ha anche utilizzato l’autoiniettore per l’allotrapianto di cellule staminali neurali tumorali2. In precedenza, l’apparato autoiniettore è stato utilizzato in Drosophila per studiare la virulenza batterica3, le infezioni parassitarie e la difesa dell’ospite4, nonché lo screening per la bioattività di diversi composti5. Il nostro protocollo adatta l’apparato autoiniettore per l’uso di iniezione tumorale e cerca di fornire ai ricercatori di Drosophila risultati di qualità superiore e più coerenti, risparmiando loro molto tempo. Questo protocollo può essere utilizzato non solo per l’allotrapianto di tumori, ma può anche essere adattato all’allotrapianto di tessuti wildtype e mutanti di calibro simile6.
Il tumore Drosophila NICD utilizzato in questo protocollo è stato introdotto per la prima volta da Yang et al.7 nella zona di transizione dell’anello immaginale SG, un “hotspot tumorale” che presenta alti livelli di endogena Janus Kinase / Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT) e c-Jun N-terminal Kinase (JNK) attività. Inoltre, la zona di transizione ha alti livelli di metalloproteinasi-1 della matrice (MMP1)7, il che rende questa regione particolarmente favorevole alla tumorigenesi. L’attivazione della via di Notch attraverso la sola sovraespressione di NICD è sufficiente per avviare costantemente la formazione del tumore. Questi tumori possono essere successivamente allotrapiantati per consentire l’indagine di una vasta gamma di argomenti, tra cui la divisione delle cellule tumorali, l’invasione e le interazioni tumore-ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’allotrapianto tumorale può aiutare i ricercatori ad affrontare alcuni problemi che sorgono durante la crescita e la progressione del tumore Drosophila. Una di queste sfide è l’elusione delle morti premature di larve o adulti portatori di tumore durante la coltura tumorale primaria12. In questo contesto, l’allotrapianto tumorale continuo consente ai tumori di crescere indefinitamente, il che facilita gli studi longitudinali sulla crescita, le metastasi e l’evoluzione del tumore. L’allo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo gli ex membri del laboratorio Dr. Sheng-An Yang e Mr. Juan-Martin Portilla per il loro contributo nello sviluppo di questo protocollo. Siamo grati al laboratorio del Dr. Yan Song presso la Scuola di Scienze della Vita dell’Università di Pechino per aver condiviso il loro protocollo sull’allotrapianto manuale. Ringraziamo anche il signor Calder Ellsworth e il signor Everest Shapiro per la lettura critica del manoscritto.
WMD ha ricevuto finanziamenti (GM072562, CA224381, CA227789) per questo lavoro dal National Institute of Health (https://www.nih.gov/) e finanziamenti (IOS-155790) dalla National Science Foundation (htps://nsf.gov/). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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