Loteamento tumoral em Drosophila melanogaster com um Injetor Auto-Nanoliter Programável
Summary
Este protocolo fornece orientação detalhada para a ação de aotransplante geracional inicial e contínua de tumores de Drosophila no abdômen de hospedeiros adultos para estudar vários aspectos da neoplasia. Usando um aparelho autoinjetor, os pesquisadores podem obter melhor eficiência e rendimentos tumorais em comparação com os alcançados pelos métodos tradicionais e manuais.
Abstract
Este protocolo descreve a aotransplantação de tumores em Drosophila melanogaster usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera. Com o uso de um aparelho autoinjetor, operadores treinados podem obter resultados de transplante mais eficientes e consistentes em comparação com aqueles obtidos usando um injetor manual. Aqui, abordamos temas de forma cronológica: desde o cruzamento das linhas de Drosophila , até a indução e dissecação do tumor primário, o transplante do tumor primário em um novo hospedeiro adulto e o transplante geracional contínuo do tumor para estudos prolongados. Como demonstração, aqui usamos o domínio intracelular notch (NICD) sobreexpressão induzida tumores de anel de glândula salivar imaginária para transplante geracional. Esses tumores podem primeiro ser induzidos de forma confiável em um microambiente de zona de transição dentro de anéis imaginários da glândula salivar larval, depois alusorados e cultivados in vivo para estudar o crescimento contínuo do tumor, evolução e metástase. Este método de aotransplante pode ser útil em programas potenciais de triagem de medicamentos, bem como para estudar interações tumorais-hospedeiros.
Introduction
Este protocolo fornece uma orientação passo-a-passo para a ação da glândula salivar larval Drosophila (SG) tumores imagináveis de anel em abdômens de hospedeiros adultos usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera (por exemplo, Nanoject). Este protocolo também fornece instruções para o subsequente re-alusão de tumores em novas gerações de hospedeiros adultos, o que oferece oportunidades para o estudo longitudinal contínuo das características tumorais, como evolução tumoral e interações tumorais-hospedeiros. O protocolo também pode ser aplicado para experimentos de triagem de drogas.
Este método foi desenvolvido para melhorar a eficácia da realização da alotransplante tumoral em Drosophila utilizando injetores manuais1, que muitas vezes são inconsistentes em suas forças de sucção e injeção, levando a resultados subótimos para alotransplante tumoral. Um aparelho autoinjetor fornece melhor controle e pode resultar em taxas mais baixas de mortalidade por moscas pós-aoenxerto. Um operador treinado poderia alcançar uma taxa de sobrevivência de host de mais de 90% com o autoinjetor, em comparação com cerca de 80% quando o injetor manual foi usado1. A taxa global de aquisição de tumores é de 60%-80% no dia 8-12 pós-aoenxerto. O tempo médio de injeção também foi melhorado de 30-40 s por mosca usando um injetor manual para 20-25 s por mosca usando o autoinjetor.
Este protocolo está entre os primeiros protocolos para usar o aparelho autoinjetor na aotransplantação do tumor Drosophila . Um estudo recente também usou o autoinjetor para aotransplantação de células-tronco neurais tumorais2. Anteriormente, o aparelho autoinjetor foi utilizado em Drosophila para estudar virulência bacteriana3, infecções parasitárias e defesahospedeira 4, bem como triagem para bioatividade de diferentes compostos5. Nosso protocolo adapta o aparelho autoinjetor para uso de injeção de tumor e busca fornecer aos pesquisadores de Drosophila resultados de maior qualidade e mais consistentes, economizando-lhes tempo considerável. Este protocolo não só pode ser usado para a aotransplantação de tumores, mas também pode ser adaptado para a aotransplantação de tecidos selvagens e mutantes de calibresemelhante 6.
O tumor de Drosophila NICD usado neste protocolo foi introduzido pela primeira vez por Yang et al.7 na zona de transição do anel imaginário SG, um “hotspot tumoral” que exibe altos níveis de atividade endógena de Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT) e atividade c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Além disso, a zona de transição possui altos níveis de matriz metaloproteinase-1 (MMP1)7, o que torna essa região particularmente propícia à tumorigênese. A ativação da via de entalhe através da superexpressão nicd é suficiente para iniciar consistentemente a formação de tumores. Esses tumores podem ser posteriormente aotransplantados para permitir a investigação de uma ampla gama de tópicos, incluindo divisão de células tumorais, invasão e interações tumorais-hospedeiros.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aotransplantação tumoral pode ajudar os pesquisadores a resolver certos problemas que surgem durante o crescimento e progressão do tumor de Drosophila. Um desses desafios é a evasão de mortes prematuras de larvas tumorais ou adultos durante a cultura do tumor primário12. Nesse contexto, a aotransplante tumoral contínua permite que os tumores cresçam indefinidamente, o que facilita estudos longitudinais de crescimento tumoral, metástase e evolução. A aotransplante tumoral tamb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos ex-membros do laboratório Dr. Sheng-An Yang e Sr. Juan-Martin Portilla por sua contribuição no desenvolvimento deste protocolo. Somos gratos pelo laboratório do Dr. Yan Song na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Pequim por compartilhar seu protocolo sobre a locotraplantação manual. Agradecemos também ao Sr. Calder Ellsworth e ao Sr. Everest Shapiro pela leitura crítica do manuscrito.
A ADM recebeu financiamento (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabalho do Instituto Nacional de Saúde (https://www.nih.gov/) e financiamento (IOS-155790) da Fundação Nacional de Ciência (htps://nsf.gov/). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
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