Alotrasplante tumoral en Drosophila melanogaster con un inyector autononalquilador programable
Summary
Este protocolo proporciona una guía detallada para el alotrasplante generacional inicial y continuo de tumores de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos para estudiar diversos aspectos de la neoplasia. Utilizando un aparato autoinyector, los investigadores pueden lograr una mejor eficiencia y rendimientos tumorales en comparación con los logrados por los métodos manuales tradicionales.
Abstract
Este protocolo describe el alotrasplante de tumores en Drosophila melanogaster utilizando un aparato de inyección de auto-nanolitrolitros. Con el uso de un aparato autoinyector, los operadores capacitados pueden lograr resultados de trasplante más eficientes y consistentes en comparación con los obtenidos utilizando un inyector manual. Aquí, cubrimos temas de manera cronológica: desde el cruce de líneas de Drosophila , hasta la inducción y disección del tumor primario, el trasplante del tumor primario en un nuevo huésped adulto y el trasplante generacional continuo del tumor para estudios extendidos. Como demostración, aquí utilizamos los tumores de anillo imaginal inducidos por la sobreexpresión del dominio intracelular Notch (NICD) para el trasplante generacional. Estos tumores pueden primero ser inducidos de manera confiable en un microambiente de zona de transición dentro de los anillos imaginales de las glándulas salivales larvales, luego aloinjertados y cultivados in vivo para estudiar el crecimiento continuo del tumor, la evolución y la metástasis. Este método de alotrasplante puede ser útil en posibles programas de detección de fármacos, así como para estudiar las interacciones tumor-huésped.
Introduction
Este protocolo proporciona una guía paso a paso para el alotrasplante de tumores de anillo imaginal de la glándula salival larval (SG) de Drosophila en el abdomen de huéspedes adultos utilizando un aparato de inyección de autonanolitros (por ejemplo, Nanoject). Este protocolo también proporciona instrucciones para el posterior reasignointe de tumores en nuevas generaciones de huéspedes adultos, lo que brinda oportunidades para el estudio longitudinal continuo de las características del tumor, como la evolución del tumor y las interacciones tumor-huésped. El protocolo también se puede aplicar a los experimentos de detección de drogas.
Este método fue desarrollado para mejorar la eficacia de la realización de alotrasplantes tumorales en Drosophila utilizando inyectores manuales1, que a menudo son inconsistentes en sus fuerzas de succión e inyección, lo que lleva a resultados subóptimos para el alotrasplante tumoral. Un aparato autoinyector proporciona un mejor control y puede resultar en tasas más bajas de mortalidad por moscas después del aloinjerto. Un operador entrenado podría lograr una tasa de supervivencia del huésped de más del 90% con el autoinyector, en comparación con alrededor del 80% cuando se utilizó el inyector manual1. La tasa general de adquisición del tumor es del 60%-80% en el día 8-12 después del aloinjerto. El tiempo promedio de inyección también se ha mejorado de 30-40 s por mosca usando un inyector manual a 20-25 s por mosca usando el autoinyector.
Este protocolo es uno de los primeros protocolos para utilizar el aparato autoinyector en el alotrasplante de tumores de Drosophila . Un estudio reciente también utilizó el autoinyector para el alotrasplante de células madre neurales tumorales2. Anteriormente, el aparato autoinyector se utilizó en Drosophila para estudiar la virulencia bacteriana3, las infecciones parasitarias y la defensa del huésped4, así como la detección de la bioactividad de diferentes compuestos5. Nuestro protocolo adapta el aparato autoinyector para el uso de inyección tumoral y busca proporcionar a los investigadores de Drosophila una mayor calidad y resultados más consistentes, al tiempo que les ahorra un tiempo considerable. Este protocolo no solo se puede utilizar para el alotrasplante de tumores, sino que también se puede adaptar al alotrasplante de tejidos silvestres y mutantes de calibre6 similar.
El tumor Drosophila NICD utilizado en este protocolo fue introducido por primera vez por Yang et al.7 en la zona de transición del anillo imaginal SG, un “punto caliente tumoral” que exhibe altos niveles de actividad endógena de Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT), y c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Además, la zona de transición tiene altos niveles de metaloproteinasa-1 de la matriz (MMP1)7, lo que hace que esta región sea particularmente propicia para la tumorigénesis. La activación de la vía de muesca a través de la sobreexpresión de NICD por sí sola es suficiente para iniciar consistentemente la formación de tumores. Estos tumores se pueden alotrasplantar posteriormente para permitir la investigación de una amplia gama de temas, incluida la división de células tumorales, la invasión y las interacciones tumor-huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
El alotrasplante tumoral puede ayudar a los investigadores a abordar ciertos problemas que surgen durante el crecimiento y la progresión del tumor de Drosophila. Uno de esos desafíos es la elusión de las muertes prematuras de larvas o adultos portadores de tumores durante el cultivo de tumores primarios12. En este contexto, el alotrasplante tumoral continuado permite que los tumores crezcan indefinidamente, lo que facilita los estudios longitudinales del crecimiento tumoral, la metást…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los ex miembros del laboratorio Dr. Sheng-An Yang y al Sr. Juan-Martin Portilla por su contribución en el desarrollo de este protocolo. Estamos agradecidos por el laboratorio del Dr. Yan Song en la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Pekín por compartir su protocolo sobre el alotrasplante manual. También agradecemos al Sr. Calder Ellsworth y al Sr. Everest Shapiro por la lectura crítica del manuscrito.
WMD recibió fondos (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabajo del Instituto Nacional de Salud (https://www.nih.gov/) y fondos (IOS-155790) de la Fundación Nacional de Ciencias (htps://nsf.gov/). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 980 | Also known as "Zeiss LSM 980" |
| Cornmeal Fly Food | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Dissection Needle (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Dissection Plate | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Fluoresence Adapter for Stero Microscope | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | Also known as "NightSea Fluorescence Adapter" |
| Fluoresence Microscope | Zeiss | 495015-0001-000 | Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Also known as "Dumont #5 Forceps" |
| Glass Capillary (3.5'') | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| Glue | Elmer | E305 | Also known as "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Light Microscope | Zeiss | 435063-9010-100 | Also known as "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Also known as "Four Step Micropipette Puller" |
| Nanoject Apparatus | Drummond | 3-000-204 | Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector" |
| Schneider's Medium | ThermoFisher | 21720001 | |
| Syringe (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| Vial | Fisherbrand | AS507 |
References
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. . Pseudomonas Methods and Protocols. , 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597 (2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753 (2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. . BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51 (2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103 (2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567 (2020).
