Bu protokolün amacı, omurilik hasarının fare modeline optimize edilmiş bir doku ayrıştırma protokolü uygulamak ve akış sitometrisi ile tek hücre analizi yaklaşımını doğrulamaktır.
Detrusor-sfinkter disserjisi, fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı ve daha sonra mesane duvarı tadilatı yapmak için farelerde omurilik hasarının uygulanmasını tarif ediyoruz. Yaralanmamış kontrol ve omurilik yaralı farelerde mesane duvarının hücresel bileşiminin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için, yüksek hücre canlılığını destekleyen ve akış sitometrisi ile ayrık alt nüfusların tespitini sağlayan optimize edilmiş bir ayrışma protokolü geliştirdik.
Omurilik yaralanması torasik omuriliğin tamamen transeksiyonu ile oluşturulur. Doku hasadı sırasında, hayvan derin anestezi altında fosfat tamponlu salin ile perfüzyona edilir ve mesaneler Tyrode’un tamponuna toplanır. Dokular, halka açık gen ekspresyon veritabanlarının sorgulanmasıyla belirlenen fare mesanesinin kollajen içeriğine göre optimize edilmiş sindirim tamponunda inkübasyondan önce kıyılır. Tek hücreli süspansiyonun üretilmesinden sonra, malzeme hücre canlılığının, hücre sayısının ve spesifik alt nüfusların değerlendirilmesi için akış sitometrisi ile analiz edilir. Yöntemin% 90’dan fazla canlılığa sahip hücre popülasyonları ve mezenkimal ve epitel kökenli hücrelerin sağlam bir şekilde temsilini sağladığını gösteriyoruz. Bu yöntem, fare mesanesinde ve potansiyel olarak diğer organlarda ayrı hücre tiplerinin doğru aşağı akış analizini sağlayacaktır.
Normal idrar kesesi fonksiyonunun pertürbasyonları birçok birey için yaşam kalitesinin düşmesine neden olabilir. Yaralanmanın veya hastalığın normal mesane fonksiyonunu nasıl raydan çıkardığını daha iyi anlamak için, mesane içindeki hücrelerin normal biyolojik durumunu ve deneysel pertürbasyon altında nasıl değiştiklerini araştırmak önemlidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, idrar kesesi içinde bulunan spesifik hücre popülasyonları ve yaralanma ile nasıl değiştikleri eksik karakterize edilmiştir.
Akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi tek hücreli profil oluşturma yöntemleri mesane içindeki belirli hücre tiplerine ışık tutma potansiyeline sahiptir. Ancak bu yaklaşımların bilgilendirici doku olabilmesi için hasat edilen dokunun canlılığını, gen ekspresyonlarını ve temsili hücre popülasyon yüzdelerini etkilemeyecek şekilde sindirilmesi gerekmektedir. Enzimatik ayrışma kullanan protokoller, ayrımsız proteaz aktivitesi1aracılığıyla yüzey işaretleyici ekspresyonunu etkileyebilir, böylece akış sitometrisi ile hücre tanımlamasını etkileyebilir, ancak ayrışma sürecinin kendisi, van den Brink ve meslektaşları tarafından yakın zamanda açıklandığı gibi, hemen erken genlerin indüksiyona yol açabilir2. Yazarlar, ayrışma etkisindeki alt nüfus küçük olmasına rağmen, hemen erken genlerin yüksek ekspresyon seviyeleri nedeniyle toplu ifade çalışmalarında güçlü bir kontamine sinyali tetikleyebileceğini göstermiştir. Ek olarak, ayrışma protokolünün süresi, bazı alt nüfuslara özgü olduğu gösterilen genlerin algılanan toplu ekspresyon seviyelerini etkiledi. Bu nedenle, ayrışma protokolünün etkisi hesaba katmadan oluşturulan tek hücreli veri kümeleri, alttaki biyolojinin aksine, ayrışma yönteminden kaynaklanan gen ekspresyon değişiklikleri sağlayabilir. Bu gözlemler, yayınlanan tek hücreli transkriptomik verilerin dikkatle yorumlanıp sonuçların bağımsız yöntemlerle doğrulanmış olması gerektiğini göstermektedir.
Her ne kadar sert ve uzun ayrışma yöntemleri hücrelerde gen ekspresyonunu değiştirebilir2; hücrelerin etkili izolasyonu, mevcut hücre tiplerinin doğru temsilini elde etmek için gereklidir. Mesane birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık bir organ olduğundan, ürotelial veya stromal hücreler gibi bazı popülasyonlar nispeten az temsil edilebilirken, fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri hücre dışı matris içinde bulunur ve izole edilmesi zor olabilir. Mesane, omurilik yaralanması 3 ,4 veya mesane çıkış tıkanıklığı5,6’dagözlenen gibi önemli bir tadilat ve fibrozis geçirmişse, ayrışma daha da zorlaşır.
Burada, omurilik yaralı fare mesanesinde aşağı akış tek hücre analizi için optimize edilmiş bir doku ayrıştırma yöntemini açıklıyoruz. Akış sitometrisini kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu verme, hücre canlılığını destekleme ve hücre popülasyonlarının doğru oranını koruma yetenekleri için dört enzimatik sindirim protokolünü karşılaştırdık. Bu analize dayanarak, hücre ölümünü, hücresel agregaları, hücresel olmayan nükleik asitleri ve aşağı akış analizinin potansiyel inhibitörlerini en aza indirmenin yüksek kaliteli verilere ulaşmak için kritik öneme sahip olduğu sonucuna varıyoruz.
Burada açıklanan fare omurilik yaralanması modeli, mesane kasılması ve dış üretral sfinkter gevşemesi arasındaki koordinasyon kaybı nedeniyle fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu da, ürotelial ve düz kas bölmelerinin genişlemesi ile karakterize edilen yaralanmadan 2 hafta sonra mesane duvarının derin tadilatını çağrıştırır. Kemirgenlerde SCI modelinin uygulanmasında kritik adımlar şunlardır: (i) yaralanmadan sonraki 10\u201214 gün boyunca ortaya çıkan omurga şoku döneminde manuel mesane ifadesine titizlikle dikkat etmek; (ii) kilo kaybını en aza indirmek için besin zenginleştirme; ve (iii) özellikle refleks geçersiz kılmanın geri dönüşünün ötesine geçen deneyler için idrar haşlama potansiyelinin azaltılması. Modelin sınırlamaları, geçici hematüri döneminde kan pıhtılarından farelerde üretral tıkanıklık potansiyelini ve ayrıca ameliyattan sonra retrograd boşalmayı takiben meni pıhtısından erkek farelerde bulunur.
Burada açıklanan doku ayrıştırma yaklaşımı, deneysel hakaretten kaynaklanan dokulardaki yapısal değişiklikleri göz önünde bulundurmanın önemini göstermektedir, bu durumda SCI’yı takiben aşağı akış analizlerini etkileyebilecek önemli doku tadilatı. Tek hücreli analizlerdeki artışla, gen ifadesinde gözlenen farklılıkların sadece ayrışmaya bağlı pertürbasyonların bir sonucu olmadığından, hastalık modeliyle ilgili temel biyolojik değişiklikleri gerçekten temsil ettiğinden emin olmak önemlidir. Herkese açık ifade verilerinin kullanımı, canlılığı en üst düzeye çıkarırken hücre dışı matrisin etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için sindirim tamponlarının formülasyonunu değiştirmemize izin sağladı. Gelecekteki uygulamalarda dikkate alınabilecek ek değişiklikler, ayrışma protokolüne duyarlı acil erken genlerin transkripsiyonunu durdurmak için aktinomycin D eklenmesini içerir15.
Pipetleme tekniği, dokuyu ayrıştırırken veya zaten süspansiyonda olan hücreleri aktarırken çok önemlidir. Kesme kuvvetlerinden hücrelere fiziksel hasarı azaltmak için, hücre resüspensiyonu sırasında yavaşça ve yavaşça pipet yapmak önemlidir. Genellikle geniş delikli pipet uçlarının kullanılması önerilir. Standart uçlar kullanıyorsanız, aksi takdirde hücrelere zarar verecek kesme kuvvetlerini önlemek için hücre süspansiyonlarını yavaşça pipetlamak özellikle önemlidir. Hücre süzgeçlerinin kullanılması bu protokolde kaçınılmazdır, ancak hücre konsantrasyonu 100 μL veya daha fazla hacim kaybı eşliğinde% 20 veya daha fazla azalabilir. Kesin bir hücre sayısı sağlamak için hücre konsantrasyonunun süzüldikten sonra belirlenmesini öneririz.
Akış sitometrisinde, FMO kontrolleri üst üste binen emisyon tepelerinden gelen sinyalin kanaması nedeniyle bir arka plan ölçüsü sağlar. Bunlar spesifik olmayan antikor bağlama veya bu kanala bir antikor dahil edildiğinde bulunabilecek arka plan boyama ölçüsü değildir. Spesifik olmayan antikor bağlamasını hesaba katmak için uygun izotip kontrollerini dahil etmek zorundadır; arka plan boyama için negatif kontroller dahil edilmesi gerekir. Birlikte ele alındığında, bu kontroller hücre popülasyonlarının doğru ölçümünü sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (R01 DK077195’ten R.M.A’ya, R01 DK104641’den R.M.A ve D.R.R..B’a) verilen hibelerle desteklendi. Hematoloji/Onkoloji Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Pediatri Bölümü, Harvard Tıp Fakültesi ve Dana-Farber Kanser Enstitüsü’nde Dr. Stuart Orkin’in değerli katkılarını kabul ediyoruz. Ayrıca Kyle Costa’nın farelerin ameliyat sonrası bakımında, Mary Taglienti ve Dr. Habiballah Shojaeisaadi’nin (Dr. Yang Shi Laboratuvarı, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi) teknik yardım ve yararlı tartışmalar için desteğini kabul ediyoruz.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |