L’obiettivo di questo protocollo è quello di applicare un protocollo di dissociazione dei tessuti ottimizzato a un modello di topo di lesione del midollo spinale e convalidare l’approccio per l’analisi a singola cellula per citometria del flusso.
Descriviamo l’implementazione della lesione del midollo spinale nei topi per provocare la dissnergia del detrusore-sfintere, un’ostruzione funzionale dell’uscita della vescica e il successivo rimodellamento della parete della vescica. Per facilitare la valutazione della composizione cellulare della parete vescicale in topi non feriti e feriti del midollo spinale, abbiamo sviluppato un protocollo di dissociazione ottimizzato che supporta un’elevata vitalità cellulare e consente il rilevamento di sottopopolazioni discrete per citometria a flusso.
La lesione del midollo spinale è creata dalla completa trasezione del midollo spinale toracico. Al momento della raccolta dei tessuti, l’animale viene perfuso con soluzione salina tamponata da fosfati in anestesia profonda e le vesciche vengono raccolte nel tampone di Tyrode. I tessuti vengono tritati prima dell’incubazione nel tampone di digestione che è stato ottimizzato in base al contenuto di collagene della vescica del topo determinato dall’interrogazione di database di espressione genica pubblicamente disponibili. Dopo la generazione di una singola sospensione cellulare, il materiale viene analizzato dalla citometria del flusso per la valutazione della vitalità cellulare, del numero di cellule e delle sottopopolazioni specifiche. Dimostriamo che il metodo produce popolazioni cellulari con una vitalità superiore al 90% e una solida rappresentazione delle cellule di origine mesenchimale ed epiteliale. Questo metodo consentirà un’accurata analisi a valle dei tipi di cellule discrete nella vescica del topo e potenzialmente in altri organi.
Le perturbazioni della normale funzione della vescica urinaria possono portare a una diminuzione della qualità della vita per molti individui. Al fine di ottenere una migliore comprensione di come lesioni o malattie deragliano la normale funzione della vescica, è importante sondare il normale stato biologico delle cellule all’interno della vescica e come cambiano sotto perturbazione sperimentale. Ad oggi, tuttavia, le specifiche popolazioni cellulari che risiedono all’interno della vescica urinaria e come cambiano con la lesione, sono state incompletamente caratterizzate.
I metodi di profilazione a singola cellula come la citometria a flusso o il sequenziamento dell’RNA a singola cella (scRNA-seq) hanno il potenziale per far luce su specifici tipi di cellule all’interno della vescica. Tuttavia, affinché questi approcci siano tessuti informativi devono essere digeriti in modo da non influire sulla vitalità, sull’espressione genica e sulle percentuali rappresentative della popolazione cellulare del tessuto raccolto. I protocolli che utilizzano la disaggregazione enzimatica possono influire sull’espressione del marcatore superficiale attraverso l’attività di proteasi indiscriminata1, influenzando così l’identificazione cellulare mediante citometria del flusso, mentre il processo di dissociazione stesso può portare all’induzione di geni precoci immediati, come descritto di recente da Van den Brink e colleghi2. Gli autori hanno dimostrato che sebbene la sottopopolazione influenzata dalla dissociazione fosse piccola, poteva innescare un forte segnale contaminante negli studi di espressione alla rinfusa a causa degli alti livelli di espressione dei primi geni immediati. Inoltre, la durata del protocollo di dissociazione interessato ha rilevato livelli di espressione di massa rilevati di geni che si sono dimostrati unici per alcune sottopopolazioni. Pertanto, i set di dati a singola cellula generati senza contabilizzarsi dell’impatto del protocollo di dissociazione possono produrre cambiamenti nell’espressione genica derivanti dal metodo di dissociazione, al contrario della biologia sottostante. Queste osservazioni suggeriscono che i dati pubblicati sulla trascritomica a singola cella dovrebbero essere interpretati con cautela e che i risultati dovrebbero essere convalidati con metodi indipendenti.
Anche se, metodi di dissociazione duri e lunghi possono alterare l’espressione genica nellecellule 2; un efficace isolamento delle cellule è essenziale per ottenere una rappresentazione accurata dei tipi di cellule presenti. Poiché la vescica è un organo complesso che comprende più tipi di cellule, alcune popolazioni come le cellule uroteliali o stromali possono essere relativamente sottorappresentate, mentre altri tipi di cellule come i fibroblasti esistono all’interno della matrice extracellulare e possono essere difficili da isolare. La dissociazione diventa ancora più impegnativa se la vescica ha subito un rimodellamento significativo e fibrosi come quella osservata nella lesione del midollo spinale3,4 o nell’ostruzione dell’uscita dellavescica 5,6.
Qui descriviamo un metodo di dissociazione dei tessuti ottimizzato per l’analisi a valle di singole cellule nella vescica del topo ferita al midollo spinale. Utilizzando la citometria del flusso, abbiamo confrontato quattro protocolli di digestione enzimatica per la loro capacità di produrre una sospensione a singola cellula, supportare la vitalità cellulare e mantenere la giusta proporzione di popolazioni cellulari. Sulla base di questa analisi, concludiamo che ridurre al minimo la morte cellulare, gli aggregati cellulari, gli acidi nucleici non cellulari e i potenziali inibitori dell’analisi a valle sono fondamentali per ottenere dati di alta qualità.
Il modello di lesione del midollo spinale del topo qui descritto fornisce un metodo riproducibile per creare un’ostruzione funzionale dell’uscita della vescica a causa della perdita di coordinazione tra la contrazione della vescica e il rilassamento esterno dello sfintere uretrale. Questo a sua volta evoca un profondo rimodellamento della parete della vescica già 2 settimane dopo l’infortunio caratterizzato dall’espansione dei compartimenti muscolari uroteliali e lisci. Le fasi critiche nell’implementazione del modello SCI nei roditori includono (i) una rigorosa attenzione all’espressione manuale della vescica durante il periodo di shock spinale che ne consegue per 10\u201214 giorni dopo la lesione; — arricchimento nutrizionale per ridurre al minimo la perdita di peso; e (iii) mitigazione del potenziale di scottatura delle urine, in particolare per esperimenti che vanno oltre il ritorno del vuoto riflesso. Le limitazioni del modello includono il potenziale di occlusione uretrale nei topi dai coaguli di sangue durante il periodo di ematuria transitoria, e inoltre nei topi maschi dal coagulo di sperma dopo l’eiaculazione retrograda dopo l’intervento chirurgico.
L’approccio di dissociazione tissutale qui descritto illustra l’importanza di considerare i cambiamenti strutturali nei tessuti che derivano dall’insulto sperimentale, in questo caso un significativo rimodellamento tissutale a seguito di SCI che può influenzare le analisi a valle. Con l’aumento delle analisi a singola cellula è fondamentale garantire che le differenze osservate nell’espressione genica non siano semplicemente il risultato di perturbazioni indotte dalla dissociazione, ma siano realmente rappresentative dei cambiamenti biologici sottostanti rilevanti per il modello della malattia. L’uso di dati di espressione pubblicamente disponibili ci ha permesso di modificare la formulazione dei tamponi di digestione per garantire un’efficace digestione della matrice extracellulare massimizzando al contempo la vitalità. Ulteriori modifiche che potrebbero essere prese in considerazione nelle applicazioni future includono l’aggiunta di actinomicina D, per fermare la trascrizione di geni precoci immediati che sono sensibili al protocollo didissociazione 15.
La tecnica di pipettazione è fondamentale quando si dissociano i tessuti o si trasferiscono cellule già in sospensione. Per ridurre i danni fisici alle cellule derivanti dalle forze di taglio, è importante pipettare delicatamente e lentamente durante la sospensione cellulare. Si consiglia generalmente di utilizzare punte di pipetta a foro largo. Se si utilizzano punte standard, è particolarmente importante pipettare delicatamente le sospensioni delle celle per evitare forze di taglio che altrimenti danneggerebbe le cellule. L’uso di filtri cellulari è inevitabile in questo protocollo, tuttavia, la concentrazione cellulare può diminuire del 20% o più, accompagnata da una perdita di volume di 100 μL o più. Si consiglia di determinare la concentrazione cellulare dopo lo sforzo per garantire un conteggio preciso delle cellule.
Nella citometria del flusso, i controlli FMO forniscono una misura dello sfondo a causa del sanguinamento del segnale da picchi di emissione sovrapposti. Non sono una misura di legame anticorpale non specifico, o colorazione di fondo che può essere presente quando un anticorpo è incluso in quel canale. Per tenere conto del legame anticorpale non specifico, è necessario includere adeguati controlli isotipi; per la colorazione di fondo, è necessario includere controlli negativi. Nel loro insieme, questi controlli garantiscono una misurazione accurata delle popolazioni cellulari.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei National Institutes of Health (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A e D.R.B). Riconosciamo il prezioso contributo del Dr. Stuart Orkin nella Divisione di Ematologia/Oncologia, nel Boston Children’s Hospital, nel Dipartimento di Pediatria, nella Harvard Medical School e nel Dana-Farber Cancer Institute. Riconosciamo anche il supporto di Kyle Costa nella cura post-operatoria dei topi, Mary Taglienti e il Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dipartimento di Pediatria, Divisione di Medicina Neonata, Dipartimento di Pediatria, Divisione di Medicina Neonata, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) per assistenza tecnica e discussioni utili.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |