Le but de ce protocole est d’appliquer un protocole optimisé de dissociation des tissus à un modèle muran de lésions médullaires et de valider l’approche pour l’analyse d’une seule cellule par cytométrie de flux.
Nous décrivons la mise en œuvre des dommages de moelle épinière chez les souris pour obtenir la dyssynergie de detrusor-sphincter, une obstruction fonctionnelle de sortie de réservoir souple, et le remodelage ultérieur de mur de réservoir souple. Pour faciliter l’évaluation de la composition cellulaire de la paroi vésicale chez les souris blessées au contrôle non blessées et à la moelle épinière, nous avons mis au point un protocole de dissociation optimisé qui favorise la viabilité des cellules élevées et permet la détection de sous-populations discrètes par cytométrie d’écoulement.
Les lésions médullaires sont créées par une transection complète de la moelle épinière thoracique. Au moment de la récolte des tissus, l’animal est perfusé de solution saline tamponnée de phosphate sous anesthésie profonde et les vessies sont récoltées dans le tampon de Tyrode. Les tissus sont émincés avant l’incubation dans le tampon de digestion qui a été optimisé en fonction de la teneur en collagène de la vessie souris tel que déterminé par l’interrogation de bases de données d’expression génétique accessibles au public. Après la génération d’une suspension cellulaire unique, le matériau est analysé par cytométrie d’écoulement pour évaluer la viabilité cellulaire, le nombre de cellules et les sous-populations spécifiques. Nous démontrons que la méthode donne des populations cellulaires avec plus de 90% de viabilité, et une représentation robuste des cellules d’origine mésenchymale et épithéliale. Cette méthode permettra une analyse précise en aval des types de cellules discrètes dans la vessie de souris et potentiellement d’autres organes.
Les perturbations de la fonction normale de la vessie urinaire peuvent entraîner une diminution de la qualité de vie de nombreuses personnes. Afin d’acquérir une meilleure compréhension de la façon dont les blessures ou les maladies font dérailler la fonction normale de la vessie, il est important de sonder l’état biologique normal des cellules dans la vessie et comment elles changent sous perturbation expérimentale. Jusqu’ici, cependant, les populations spécifiques de cellules qui résident dans la vessie urinaire, et comment elles changent avec des dommages, ont été incomplètement caractérisées.
Les méthodes de profilage à cellules simples telles que la cytométrie d’écoulement ou le séquençage de l’ARN unicellule (scRNA-seq) ont le potentiel de faire la lumière sur des types de cellules spécifiques dans la vessie. Toutefois, pour que ces approches soient informatives, les tissus doivent être digérés d’une manière qui n’affecte pas la viabilité, l’expression des gènes et les pourcentages représentatifs de population cellulaire du tissu récolté. Les protocoles qui emploient la désagrégation enzymatique peuvent avoir un impact sur l’expression des marqueurs de surface par l’activité indiscriminée de la protéase1,ce qui a un impact sur l’identification cellulaire par cytométrie de flux, tandis que le processus de dissociation lui-même peut conduire à l’induction de gènes précoces immédiats, comme décrit récemment par Van den Brink etses collègues 2. Les auteurs ont prouvé que bien que la sous-population dissociation-affectée était petite, elle pourrait déclencher un signal contaminant fort dans des études d’expression en vrac dues aux niveaux élevés d’expression des gènes tôt immédiats. En outre, la durée du protocole de dissociation a affecté les niveaux d’expression en vrac détectés des gènes montrés pour être uniques à certaines sous-populations. Ainsi, les ensembles de données à cellules simples générés sans tenir compte de l’impact du protocole de dissociation peuvent produire des changements d’expression génétique découlant de la méthode de dissociation, par opposition à la biologie sous-jacente. Ces observations suggèrent que les données publiées sur la transcriptomics à cellule unique doivent être interprétées avec prudence et que les résultats devraient être validés par des méthodes indépendantes.
Bien que, des méthodes de dissociation dures et longues puissent modifier l’expression des gènes dans lescellules 2; l’isolement efficace des cellules est essentiel pour obtenir une représentation précise des types de cellules présents. Puisque la vessie est un organe complexe comprenant plusieurs types de cellules, certaines populations telles que les cellules urothelial ou stromal peuvent être relativement sous-représentées tandis que d’autres types de cellules telles que les fibroblastes existent dans la matrice extracellulaire et peuvent être difficiles à isoler. La dissociation devient encore plus difficile si la vessie a subi le remodelage et la fibrose significatifs tels que celui observé dans les dommages de moelleépinière 3,4 ou obstruction de sortie de réservoir souple5,6.
Ici, nous décrivons une méthode optimisée de dissociation de tissu pour l’analyse simple en aval de cellules dans la vessie blessée de souris de moelle épinière. En utilisant la cytométrie de flux, nous avons comparé quatre protocoles de digestion enzymatiques pour leur capacité à produire une suspension cellulaire unique, soutenir la viabilité cellulaire et maintenir la proportion correcte de populations cellulaires. Sur la base de cette analyse, nous concluons que la minimisation de la mort cellulaire, des agrégats cellulaires, des acides nucléiques non cellulaires et des inhibiteurs potentiels de l’analyse en aval est essentielle à la réalisation de données de haute qualité.
Le modèle de lésion de moelle épinière de souris décrit ici fournit une méthode reproductible pour créer une obstruction fonctionnelle de sortie de réservoir souple due à la perte de coordination entre la contraction de réservoir souple et la relaxation externe de sphincter urétral. Ceci évoque à son tour le remodelage profond de la paroi de réservoir souple dès 2 semaines après blessure caractérisée par l’expansion des compartiments urothelial et lisses de muscle. Les étapes critiques dans la mise en œuvre du modèle SCI chez les rongeurs comprennent (i) une attention rigoureuse à l’expression manuelle de la vessie pendant la période de choc rachidien qui s’ensuit pendant 10\u201214 jours après une blessure; (ii) l’enrichissement nutritionnel pour minimiser la perte de poids; et (iii) l’atténuation du potentiel d’échaudage de l’urine, en particulier pour les expériences qui vont au-delà du retour de l’annulation réflexe. Les limitations du modèle incluent le potentiel pour l’occlusion urétrale chez les souris des caillots sanguins pendant la période de l’hématurie passagère, et en outre chez les souris mâles du coagulum de sperme suivant l’éjaculation rétrograde suivant la chirurgie.
L’approche de dissociation tissulaire décrite ici illustre l’importance de considérer les changements structurels dans les tissus qui découlent de l’insulte expérimentale, dans ce cas le remodelage significatif de tissu suivant SCI qui peut influencer des analyses en aval. Avec l’augmentation des analyses à cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que les différences observées dans l’expression des gènes ne sont pas simplement le résultat de perturbations induites par la dissociation, mais sont vraiment représentatives des changements biologiques sous-jacents pertinents au modèle de la maladie. L’utilisation de données d’expression accessibles au public nous a permis de modifier la formulation des tampons de digestion afin d’assurer une digestion efficace de la matrice extracellulaire tout en maximisant la viabilité. D’autres modifications qui pourraient être considérées dans les applications futures incluent l’ajout de l’actinomycine D, pour arrêter la transcription des gènes tôt immédiats qui sont sensibles au protocole de dissociation15.
La technique de pipetage est cruciale lors de la dissociation des tissus ou du transfert de cellules déjà en suspension. Pour réduire les dommages physiques aux cellules des forces de cisaillement, il est important de pipette doucement et lentement pendant la résuspension cellulaire. Il est généralement recommandé d’utiliser des pointes de pipette à alésage large. Si vous utilisez des pointes standard, il est particulièrement important de pipette suspensions cellulaires doucement pour éviter les forces de cisaillement qui autrement endommager les cellules. L’utilisation de passoires cellulaires est inévitable dans ce protocole, cependant, la concentration cellulaire peut diminuer de 20% ou plus, accompagnée d’une perte de volume de 100 μL ou plus. Nous recommandons que la concentration cellulaire soit déterminée après la tension afin d’assurer un dénombrement précis des cellules.
Dans la cytométrie de débit, les contrôles fmo fournissent une mesure de fond due à la purge du signal des pics d’émission qui se chevauchent. Il ne s’agit pas d’une mesure de liaison non spécifique des anticorps ou d’une coloration de fond qui peut être présente lorsqu’un anticorps est inclus dans ce canal. Pour tenir compte de la liaison anticorps non spécifique, il faut inclure des contrôles appropriés de l’isotype; pour la coloration de fond, il faut inclure des contrôles négatifs. Pris ensemble, ces contrôles assurent une mesure précise des populations cellulaires.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus par des subventions des National Institutes of Health (R01 DK077195 à R.M.A, R01 DK104641 à R.M.A et D.R.B). Nous reconnaissons l’apport précieux du Dr Stuart Orkin de la Division d’hématologie et d’oncologie du Boston Children’s Hospital, du Département de pédiatrie, de la Harvard Medical School et du Dana-Farber Cancer Institute. Nous reconnaissons également le soutien de Kyle Costa dans les soins postopératoires des souris, Mary Taglienti et le Dr Habiballah Shojaeisaadi (Dr Yang Shi Laboratory, Département de pédiatrie, Division de médecine néonaïne, Département de pédiatrie, Division de médecine néonaïne, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) pour l’assistance technique et des discussions utiles.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |