Het doel van dit protocol is om een geoptimaliseerd weefseldissociatieprotocol toe te passen op een muismodel van ruggenmergletsel en de aanpak voor eencellige analyse door stroomcytometrie te valideren.
We beschrijven de implementatie van ruggenmergletsel bij muizen om detrusor-sluitspierdysynergie, een functionele obstructie van de blaasuitlaat en daaropvolgende herinrichting van de blaaswand uit te lokken. Om de beoordeling van de cellulaire samenstelling van de blaaswand bij niet-gewonde controle en ruggenmerggewonde muizen te vergemakkelijken, ontwikkelden we een geoptimaliseerd dissociatieprotocol dat een hoge levensvatbaarheid van de cel ondersteunt en de detectie van discrete subpopulaties door stroomcytometrie mogelijk maakt.
Dwarslaesie ontstaat door volledige transsectie van het thoracale ruggenmerg. Op het moment van weefseloogst wordt het dier doordrenkt met fosfaatgebufferde zoutoplossing onder diepe anesthesie en worden blaasjes geoogst in de buffer van Tyrode. Weefsels worden gehakt voorafgaand aan incubatie in de spijsverteringsbuffer die is geoptimaliseerd op basis van het collageengehalte van de muisblaas, zoals bepaald door ondervraging van openbaar beschikbare genexpressiedatabases. Na het genereren van een suspensie met één cel wordt materiaal geanalyseerd door stroomcytometrie voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, het celnummer en specifieke subpopulaties. We tonen aan dat de methode celpopulaties oplevert met een levensvatbaarheid van meer dan 90% en een robuuste weergave van cellen van mesenchymale en epitheeloorsprong. Deze methode maakt een nauwkeurige downstream-analyse van discrete celtypen in de muisblaas en mogelijk andere organen mogelijk.
Verstoringen van de normale urineblaasfunctie kunnen voor veel mensen leiden tot een verminderde kwaliteit van leven. Om een beter inzicht te krijgen in hoe letsel of ziekte de normale blaasfunctie ontspoort, is het belangrijk om de normale biologische toestand van cellen in de blaas te onderzoeken en hoe ze veranderen bij experimentele verstoring. Tot op heden zijn de specifieke celpopulaties die zich in de urineblaas bevinden en hoe ze veranderen met letsel, echter onvolledig gekarakteriseerd.
Eencellige profileringsmethoden zoals flowcytometrie of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) hebben het potentieel om licht te werpen op specifieke celtypen in de blaas. Om deze benaderingen informatief weefsel te laten zijn, moet echter worden verteerd op een manier die de levensvatbaarheid, genexpressie en representatieve celpopulatiepercentages van het geoogste weefsel niet beïnvloedt. Protocollen die enzymatische disaggregatie toepassen, kunnen de expressie van oppervlaktemarkers beïnvloeden door willekeurige proteaseactiviteit1, waardoor de celidentificatie door stroomcytometrie wordt beïnvloed, terwijl het dissociatieproces zelf kan leiden tot de inductie van onmiddellijke vroege genen, zoals onlangs beschreven door Van den Brink en collega’s2. De auteurs toonden aan dat hoewel de door dissociatie aangetaste subpopulatie klein was, het een sterk vervuilend signaal kon veroorzaken in bulkexpressiestudies vanwege de hoge expressieniveaus van onmiddellijke vroege genen. Bovendien, de duur van de dissociatie protocol beïnvloed gedetecteerd bulk expressie niveaus van genen aangetoond dat uniek zijn voor sommige subpopulaties. Zo kunnen gegevenssets met één cel die worden gegenereerd zonder rekening te houden met de impact van het dissociatieprotocol genexpressieveranderingen opleveren die voortvloeien uit de dissociatiemethode, in tegenstelling tot de onderliggende biologie. Deze observaties suggereren dat gepubliceerde transcriptomics-gegevens met één cel met voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd en dat de resultaten met onafhankelijke methoden moeten worden gevalideerd.
Hoewel harde en langdurige dissociatiemethoden de genexpressie in cellen2kunnen veranderen ; effectieve isolatie van cellen is essentieel om een nauwkeurige weergave van de aanwezige celtypen te verkrijgen. Aangezien de blaas een complex orgaan is dat uit meerdere celtypen bestaat, kunnen sommige populaties zoals urotheliale of stromale cellen relatief ondervertegenwoordigd zijn, terwijl andere celtypen zoals fibroblasten bestaan binnen de extracellulaire matrix en een uitdaging kunnen zijn om te isoleren. Dissociatie wordt nog uitdagender als de blaas een aanzienlijke remodellering en fibrose heeft ondergaan, zoals die waargenomen bij dwarslaesie3,4 of obstructie van de blaasuitlaat5,6.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde weefseldissociatiemethode voor downstream eencellige analyse in de gewonde muisblaas van het ruggenmerg. Met behulp van flowcytometrie vergeleken we vier enzymatische spijsverteringsprotocollen voor hun vermogen om een suspensie met één cel op te leveren, de levensvatbaarheid van cellen te ondersteunen en het juiste aandeel celpopulaties te behouden. Op basis van deze analyse concluderen we dat het minimaliseren van celdood, cellulaire aggregaten, niet-cellulaire nucleïnezuren en potentiële remmers van downstream-analyse van cruciaal belang zijn voor het bereiken van hoogwaardige gegevens.
Het hier beschreven letselmodel van het ruggenmerg van de muis biedt een reproduceerbare methode om een functionele obstructie van de blaasuitlaat te creëren als gevolg van verlies van coördinatie tussen blaascontractie en externe uretthrale sluitspierontspanning. Dit roept op zijn beurt al 2 weken na de verwonding een grondige remodellering van de blaaswand op, gekenmerkt door uitbreiding van urotheliale en gladde spiercompartimenten. Kritieke stappen in de implementatie van het SCI-model bij knaagdieren omvatten (i) strikte aandacht voor handmatige blaasexpressie tijdens de periode van spinale shock die volgt gedurende 10 \u201214 dagen na letsel; ii) voedingsverrijking om gewichtsverlies tot een minimum te beperken; en iii) beperking van het potentieel voor urineverbranding, met name voor experimenten die verder gaan dan de terugkeer van reflexleegte. Beperkingen van het model omvatten het potentieel voor uretritale occlusie bij muizen uit bloedstolsels tijdens de periode van voorbijgaande hematurie, en bovendien bij mannelijke muizen uit spermacoagulum na retrograde ejaculatie na een operatie.
De hier beschreven weefseldissociatiebenadering illustreert het belang van het overwegen van structurele veranderingen in weefsels die voortvloeien uit de experimentele belediging, in dit geval significante weefselremodellering na SCI die downstreamanalyses kan beïnvloeden. Met de toename van eencellige analyses is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat verschillen in genexpressie niet alleen het gevolg zijn van dissociatie-geïnduceerde verstoringen, maar echt representatief zijn voor onderliggende biologische veranderingen die relevant zijn voor het ziektemodel. Het gebruik van openbaar beschikbare expressiegegevens stelde ons in staat om de formulering van vergistingsbuffers aan te passen om een effectieve vertering van extracellulaire matrix te garanderen en tegelijkertijd de levensvatbaarheid te maximaliseren. Aanvullende wijzigingen die in toekomstige toepassingen kunnen worden overwogen, zijn onder meer de toevoeging van actinomycine D, om transcriptie van onmiddellijke vroege genen die gevoelig zijn voor het dissociatieprotocol15te stoppen .
Pipetting techniek is cruciaal bij het dissocieren van weefsel of het overbrengen van cellen die al in suspensie zijn. Om fysieke schade aan cellen door afschuifkrachten te verminderen, is het belangrijk om zacht en langzaam te pipetten tijdens celreuspensie. Het wordt over het algemeen aanbevolen om pipetpunten met brede boring te gebruiken. Als u standaardtips gebruikt, is het vooral belangrijk om celsuspensies voorzichtig te pipetten om afschuifkrachten te voorkomen die anders cellen zouden beschadigen. Het gebruik van celstammen is onvermijdelijk in dit protocol, maar de celconcentratie kan met 20% of meer dalen, vergezeld van een volumeverlies van 100 μL of meer. We raden aan om de celconcentratie na het persen te bepalen om een nauwkeurig aantal cellen te garanderen.
In flowcytometrie bieden FMO-controles een meting van de achtergrond als gevolg van het bloeden van signalen van overlappende emissiepieken. Ze zijn geen maat voor niet-specifieke antilichaambinding of achtergrondvlekken die aanwezig kunnen zijn wanneer een antilichaam in dat kanaal wordt opgenomen. Om rekening te houden met de niet-specifieke antilichaambinding, moet men passende isotypecontroles opnemen; voor de achtergrondkleuring moet men negatieve controles opnemen. Samen zorgen deze controles voor een nauwkeurige meting van celpopulaties.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK077195 aan R.M.A, R01 DK104641 aan R.M.A en D.R.B). We erkennen waardevolle input van Dr. Stuart Orkin in de Afdeling Hematologie/Oncologie, Boston Children’s Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School en het Dana-Farber Cancer Institute. We erkennen ook steun van Kyle Costa bij postoperatieve zorg voor muizen, Mary Taglienti en Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) voor technische hulp en nuttige discussies.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |