الهدف من هذا البروتوكول هو تطبيق بروتوكول تفكك الأنسجة الأمثل لنموذج الماوس من إصابة الحبل الشوكي والتحقق من صحة النهج لتحليل خلية واحدة عن طريق تدفق الخلايا.
نحن نصف تنفيذ إصابة الحبل الشوكي في الفئران لإثارة detrusor-العضلة العاصرة dyssynergia، وعرقلة منفذ المثانة الوظيفية، وإعادة عرض جدار المثانة اللاحقة. لتسهيل تقييم التركيب الخلوي للجدار المثانة في السيطرة غير المصابة والفئران المصابة الحبل الشوكي، وضعنا بروتوكول تفكك الأمثل الذي يدعم قابلية الخلية العالية للحياة وتمكن من الكشف عن السكان الفرعية منفصلة عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة.
يتم إنشاء إصابة الحبل الشوكي عن طريق النقل الكامل للحبل الشوكي الصدري. في وقت حصاد الأنسجة ، يتم غرس الحيوان مع المالحة المخزنة بالفوسفات تحت التخدير العميق ويتم حصاد المثانة في المخزن المؤقت لـ Tyrode. يتم مفروم الأنسجة قبل الحضانة في العازلة الهضم التي تم تحسينها على أساس محتوى الكولاجين من المثانة الماوس كما يحددها استجواب قواعد بيانات التعبير الجيني المتاحة للجمهور. بعد جيل من تعليق خلية واحدة، يتم تحليل المواد عن طريق تدفق القياس الخلوي لتقييم صلاحية الخلية، وعدد الخلايا والستاترات الفرعية محددة. نبرهن أن الطريقة تعطي مجموعات خلايا ذات قدرة على البقاء تزيد عن 90٪ وتمثيل قوي للخلايا ذات الأصل الظهاري الظهاري. هذه الطريقة ستمكن من تحليل دقيق المصب لأنواع الخلايا المنفصلة في مثانة الماوس والأعضاء الأخرى المحتملة.
يمكن أن تؤدي اضطرابات وظيفة المثانة البولية الطبيعية إلى انخفاض نوعية الحياة للعديد من الأفراد. من أجل الحصول على فهم أفضل لكيفية إصابة أو مرض يخرج عن مسارها وظيفة المثانة الطبيعية، من المهم أن التحقيق في الحالة البيولوجية الطبيعية للخلايا داخل المثانة وكيف أنها تتغير تحت الانزعاج التجريبي. حتى الآن، ومع ذلك، فإن مجموعات الخلايا المحددة التي تتواجد داخل المثانة البولية، وكيف تتغير مع الإصابة، قد تم وصفها بشكل غير كامل.
طرق تحديد الخلايا المفردة مثل عملية التدفق الخلوي أو تسلسل الحمض النووي الريبي (scRNA-seq) أحادي الخلية لديه القدرة على إلقاء الضوء على أنواع خلايا معينة داخل المثانة. ومع ذلك، لهذه النهج أن تكون الأنسجة الإعلامية يجب أن يهضم بطريقة لا تؤثر على البقاء، والتعبير الجيني، والنسب المئوية تمثيل عدد الخلايا من الأنسجة المقطوعة. يمكن أن تؤثر البروتوكولات التي تستخدم الإنزيمية في التصنيف على التعبير عن علامة السطح من خلال نشاط البروتياز العشوائي1، وبالتالي التأثير على تحديد الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، في حين أن عملية الانفصام نفسها يمكن أن تؤدي إلى تحريض الجينات المبكرة الفورية ، كما وصفها مؤخرًا فان دين برينك وزملاؤه2. أظهر المؤلفون أنه على الرغم من أن السكان الفرعيين المتأثرين بالتفكك كانت صغيرة ، إلا أنه يمكن أن يؤدي إلى إشارة ملوثة قوية في دراسات التعبير السائب بسبب مستويات التعبير العالية للجينات المبكرة الفورية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مدة بروتوكول الانفصام التي أثرت على مستويات التعبير السائب للجينات التي تبين أنها فريدة من نوعها لبعض المستويات الفرعية. وهكذا، فإن مجموعات البيانات التي يتم إنشاؤها من خلايا واحدة دون حساب تأثير بروتوكول الانفصام قد تسفر عن تغيرات في التعبير الجيني الناشئة عن طريقة الانفصام، بدلاً من البيولوجيا الأساسية. وتشير هذه الملاحظات إلى أنه ينبغي تفسير بيانات نسخ الخلية الواحدة المنشورة بحذر، وأن النتائج يجب أن تُثبت بواسطة أساليب مستقلة.
على الرغم من أن, طرق التفكك قاسية وطويلة قد يغير التعبير الجيني في الخلايا2; العزل الفعال للخلايا أمر ضروري للحصول على تمثيل دقيق لأنواع الخلايا الموجودة. منذ المثانة هو جهاز معقد يتألف من أنواع الخلايا المتعددة، قد تكون بعض السكان مثل الخلايا المسالك البولية أو الخلايا الوماضة نسبيا تمثيلا ناقصا في حين أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الليفية موجودة داخل مصفوفة خارج الخلية ويمكن أن يكون تحديا لعزل. يصبح الانفصام أكثر تحديا إذا كانت المثانة قد خضعت لإعادة عرض كبيرة والتليف مثل تلك التي لوحظت في إصابة الحبل الشوكي3,4 أو انسداد منفذ المثانة5,6.
هنا، نحن وصف طريقة تفكك الأنسجة الأمثل لتحليل الخلايا المفردة المصب في المثانة الماوس المصاب الحبل الشوكي. باستخدام عملية استئصال الخلايا التدفق، قارنا أربعة بروتوكولات الهضم الأنزيمية لقدرتها على إنتاج تعليق خلية واحدة، ودعم جدوى الخلية والحفاظ على النسبة الصحيحة من مجموعات الخلايا. وبناءً على هذا التحليل، نستنتج أن تقليل موت الخلايا، والمجاميع الخلوية، والأحماض النووية غير الخلوية، والمثبطات المحتملة لتحليل المصب، هي أمر بالغ الأهمية لتحقيق بيانات عالية الجودة.
نموذج إصابة النخاع الشوكي الماوس الموصوف هنا يوفر طريقة استنساخها لإنشاء انسداد منفذ المثانة الوظيفية بسبب فقدان التنسيق بين انكماش المثانة والاسترخاء العضلة العاصرة مجرى البول الخارجي. وهذا بدوره يثير إعادة عرض عميق من جدار المثانة في وقت مبكر من 2 أسابيع بعد الإصابة التي تتميز بتوسع المقصورات العضلية وناعمة. وتشمل الخطوات الحاسمة في تنفيذ نموذج SCI في القوارض (1) الاهتمام الصارم بتعبير المثانة اليدوي خلال فترة الصدمة الشوكية التي تترتب على ذلك لمدة 10 أيام بعد الإصابة؛ و(ب) التركيز الدقيق على التعبير اليدوي للمثانة خلال فترة الصدمة الشوكية التي تترتب على ذلك؛ و(ب) التركيز على استخدام الأراضي في النخاع الشوكي. ‘2’ الإثراء التغذوي لتقليل فقدان الوزن؛ و (3) التخفيف من احتمالية حرق البول خاصة بالنسبة للتجارب التي تمتد إلى ما بعد عودة الفراغ المنعك. وتشمل القيود على النموذج احتمال انسداد مجرى البول في الفئران من جلطات الدم خلال فترة البيلة الدموية العابرة، وبالإضافة إلى ذلك في الفئران الذكور من النياجولوم بعد القذف الرجعية بعد الجراحة.
يوضح نهج تفكك الأنسجة الموصوف هنا أهمية النظر في التغيرات الهيكلية في الأنسجة التي تنشأ عن الإهانة التجريبية ، وفي هذه الحالة إعادة عرض الأنسجة الهامة بعد SCI التي قد تؤثر على تحليلات المصب. مع الزيادة في تحليلات الخلايا المفردة من المهم التأكد من أن الاختلافات التي لوحظت في التعبير الجيني ليست مجرد نتيجة للأمراض الناجمة عن الانفصام، بل هي تمثل حقا التغيرات البيولوجية الأساسية ذات الصلة لنموذج المرض. استخدام البيانات التعبير المتاحة للجمهور سمح لنا لتعديل صياغة العازلة الهضم لضمان الهضم الفعال للمصفوفة خارج الخلية مع تعظيم الجدوى. وتشمل التعديلات الإضافية التي يمكن النظر في التطبيقات المستقبلية إضافة actinomycin D، لوقف النسخ من الجينات في وقت مبكر الفوري التي هي حساسة لبروتوكول الانفصام15.
تقنية الأنابيب أمر بالغ الأهمية عند فصل الأنسجة أو نقل الخلايا التي هي بالفعل في التعليق. للحد من الأضرار المادية للخلايا من قوات القص، من المهم أن الماصات بلطف وببطء أثناء إعادة دمج الخلايا. من المستحسن عموما لاستخدام نصائح واسعة تتحمل ماصة. إذا كان استخدام النصائح القياسية, من المهم بشكل خاص إلى تعليق الخلية ماص بلطف لتجنب القوى القص التي من شأنها أن تضر الخلايا. استخدام مصافي الخلايا أمر لا مفر منه في هذا البروتوكول، ومع ذلك، يمكن أن ينخفض تركيز الخلية بنسبة 20٪ أو أكثر، يرافقه فقدان حجم 100 ميكرولتر أو أكثر. نوصي بتحديد تركيز الخلايا بعد الإجهاد لضمان عدد الخلايا الدقيق.
في قياس التدفق، توفر عناصر التحكم FMO مقياسًا للخلفية بسبب النزف من خلال الإشارة من قمم الانبعاثات المتداخلة. فهي ليست مقياساً لربط الأجسام المضادة غير المحددة، أو تلطيخ الخلفية الذي قد يكون موجوداً عند تضمين جسم مضاد في تلك القناة. لحساب لاتلّاق الأجسام المضادة غير محددة، يجب على المرء أن يتضمن عناصر تحكم isotype المناسبة؛ لخلفية تلطيخ، يحتاج المرء إلى تضمين الضوابط السلبية. ومع أخذ هذه الضوابط معا، فإن هذه الضوابط تضمن قياس أعداد الخلايا قياسا دقيقا.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK077195 إلى R.M.A، R01 DK104641 إلى R.M.A وD.R.B). ونحن نقدر على مدخلات قيمة من الدكتور ستيوارت أوركين في قسم أمراض الدم / الأورام، مستشفى بوسطن للأطفال، قسم طب الأطفال، كلية الطب بجامعة هارفارد ومعهد دانا فاربر للسرطان. كما نعترف بالدعم المقدم من كايل كوستا في الرعاية اللاحقة للجراحة للفئران، ماري تاغلينتي والدكتور حبيب الله شوجايساري (مختبر الدكتور يانغ شي، قسم طب الأطفال، قسم طب حديثي الولادة، قسم طب الأطفال، قسم طب حديثي الولادة، مستشفى بوسطن للأطفال، كلية الطب بجامعة هارفارد) للحصول على المساعدة التقنية والمناقشات المفيدة.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |