מטרת פרוטוקול זה היא להחיל פרוטוקול ניתוק רקמות ממוטב על מודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה ולאמת את הגישה לניתוח תא יחיד על ידי ציטומטריית זרימה.
אנו מתארים את היישום של פגיעה בחוט השדרה בעכברים כדי לעורר detrusor-sphincter dyssynergia, חסימת שקע שלפוחית השתן תפקודית, ושיפוץ דופן שלפוחית השתן הבאים. כדי להקל על הערכת ההרכב התאי של דופן שלפוחית השתן בעכברים פצועים שאינם פצועים בבקרה ובחוט השדרה, פיתחנו פרוטוקול דיסוציאציה אופטימלי התומך בכדאיות גבוהה של התאים ומאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות נפרדות על ידי ציטומטריית זרימה.
פגיעה בחוט השדרה נוצרת על ידי טרנסציה מלאה של חוט השדרה בבית החזה. בזמן קצירת הרקמות, החיה חדורת מלוחים עם אגירת פוספט תחת הרדמה עמוקה ושלפוחיות השתן נקצרות לתוך החיץ של טיירוד. רקמות טחונות לפני הדגירה במאגר העיכול כי כבר אופטימיזציה המבוססת על תכולת הקולגן של שלפוחית השתן של העכבר כפי שנקבע על ידי חקירה של מסדי נתונים ביטוי גנים זמין לציבור. לאחר הדור של השעיית תא יחיד, החומר מנותח על ידי cytometry זרימה להערכת הכדאיות של התא, מספר התא ותת-אוכלוסיות ספציפיות. אנו מראים כי השיטה מניבה אוכלוסיות תאים עם יותר מ 90% הכדאיות, וייצוג חזק של תאים ממוצא mesenchymal ואפיתל. שיטה זו תאפשר ניתוח מדויק במורד הזרם של סוגי תאים דיסקרטיים בשלפוחית השתן של העכבר ובאיברים אחרים פוטנציאליים.
הפרעות לתפקוד תקין של שלפוחית השתן יכולות להוביל לירידה באיכות החיים של אנשים רבים. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של איך פציעה או מחלה משבשת תפקוד תקין של שלפוחית השתן, חשוב לחקור את המצב הביולוגי הרגיל של תאים בתוך שלפוחית השתן וכיצד הם משתנים תחת הפרעה ניסיונית. עד כה, עם זאת, אוכלוסיות התאים הספציפיות השוכנות בתוך שלפוחית השתן, וכיצד הן משתנות עם פציעה, התאפיינו באופן חלקי.
שיטות פרופיל תא יחיד כגון cytometry זרימה או רצף RNA תא יחיד (scRNA-seq) יש פוטנציאל לשפוך אור על סוגי תאים ספציפיים בתוך שלפוחית השתן. עם זאת, עבור גישות אלה להיות רקמה אינפורמטיבית חייב להיות מתעכל באופן שאינו משפיע על הכדאיות, ביטוי גנים, ואת אחוזי אוכלוסיית התא הייצוגי של הרקמה שנקטפו. פרוטוקולים המעסיקים הפרדה אנזימטית יכולים להשפיע על ביטוי סמן פני השטח באמצעות פעילות פרוטאז ללא הבחנה1, ובכך להשפיע על זיהוי התא על ידי cytometry זרימה, ואילו תהליך הדיסוציאציה עצמו יכול להוביל אינדוקציה של גנים מוקדמים מיידיים, כפי שתואר לאחרונה על ידי ואן דן ברינק ועמיתיו2. המחברים הראו כי למרות תת-אוכלוסיית מושפע דיסוציאציה היה קטן, זה יכול לעורר אות מזהם חזק במחקרים ביטוי בתפזורת בשל רמות ביטוי גבוהות של גנים מוקדמים מיידית. בנוסף, משך פרוטוקול הדיסוציאציה המושפע זיהה רמות ביטוי בתפזורת של גנים המוצגים כייחודיים לכמה אוכלוסיות משנה. לפיכך, ערכות נתונים של תא יחיד שנוצרו מבלי להביא בחשבון את ההשפעה של פרוטוקול הדיסוציאציה עשויות להניב שינויים בביטוי הגנים הנובעים משיטת הדיסוציאציה, בניגוד לביולוגיה הבסיסית. תצפיות אלה מצביעות על כך שיש לפרש בזהירות נתוני תעתיקים של תא יחיד שפורסמו, וכי יש לאמת את התוצאות בשיטות עצמאיות.
אמנם, שיטות דיסוציאציה קשות וממושכות עשויות לשנות את ביטוי הגנים בתאים2; בידוד יעיל של תאים חיוני כדי לקבל ייצוג מדויק של סוגי התאים הקיימים. מכיוון ששלפוחית השתן היא איבר מורכב המורכב מסוגי תאים מרובים, אוכלוסיות מסוימות כגון תאים urothelial או stromal עשויות להיות מיוצגות באופן יחסי, בעוד שסוגי תאים אחרים כגון פיברובלסטים קיימים בתוך מטריצה חוץ-תאית ויכולים להיות מאתגרים לבידוד. דיסוציאציה הופכת למאתגרת עוד יותר אם שלפוחית השתן עברה שיפוץ ופיברוזיס משמעותיים כגון זה שנצפה בפגיעה בחוט השדרה3,4 או חסימת שקע שלפוחית השתן5,6.
כאן, אנו מתארים שיטת ניתוק רקמות אופטימלית לניתוח תא יחיד במורד הזרם בשלפוחית השתן הפגועה של העכבר. באמצעות ציטומטריית זרימה, השווינו ארבעה פרוטוקולי עיכול אנזימטיים ליכולתם להניב השעיית תא יחיד, לתמוך בכדאיות התא ולשמור על השיעור הנכון של אוכלוסיות התאים. בהתבסס על ניתוח זה, אנו מסיקים כי מזעור מוות תאי, אגרגטים תאיים, חומצות גרעין לא תאיות ומעכבים פוטנציאליים של ניתוח במורד הזרם הם קריטיים להשגת נתונים באיכות גבוהה.
מודל הפגיעה בחוט השדרה של העכבר המתואר כאן מספק שיטה לשחזור כדי ליצור חסימת שקע שלפוחית השתן תפקודית עקב אובדן קואורדינציה בין התכווצות שלפוחית השתן לבין הרפיה בספינקטר השופכה החיצוני. זה בתורו מעורר שיפוץ עמוק של דופן שלפוחית השתן כבר 2 שבועות לאחר פציעה המאופיינת על ידי הרחבת תאי שרירים urothelial וחלק. צעדים קריטיים ביישום מודל SCI במכרסמים כוללים (i) תשומת לב קפדנית לביטוי ידני של שלפוחית השתן במהלך תקופת ההלם בעמוד השדרה הנובעת במשך 10\u201214 ימים לאחר פציעה; (ii) העשרה תזונתית כדי למזער את הירידה במשקל; ו-(iii) צמצום הפוטנציאל לצירופ שתן במיוחד לניסויים המשתרעים מעבר להחזרת רפלקסים. מגבלות המודל כוללות את הפוטנציאל לחסימת השופכה בעכברים מקרישי דם במהלך תקופת המטוריה חולפת, ובנוסף בעכברים זכרים מזרע קוגולום לאחר שפיכה לאחור לאחר הניתוח.
גישת ניתוק הרקמות המתוארת כאן ממחישה את החשיבות של התחשבות בשינויים מבניים ברקמות הנובעים מהעלבון הניסיוני, במקרה זה שיפוץ רקמות משמעותי בעקבות SCI שעשוי להשפיע על ניתוחים במורד הזרם. עם העלייה בניתוחי תאים בודדים זה קריטי כדי להבטיח כי ההבדלים שנצפו ביטוי גנים אינם רק תוצאה של הפרעות הנגרמות על ידי דיסוציאציה, אבל הם מייצגים באמת של שינויים ביולוגיים הבסיסיים הרלוונטיים למודל המחלה. השימוש בנתוני ביטוי הזמינים לציבור איפשר לנו לשנות את ניסוח מאגרי העיכול כדי להבטיח עיכול יעיל של מטריצה חוץ-תאית תוך מקסום הכדאיות. שינויים נוספים שניתן לשקול ביישומים עתידיים כוללים תוספת של actinomycin D, כדי לעצור את שעתוק של גנים מוקדמים מיידית רגישים לפרוטוקול ניתוק15.
טכניקת Pipeting היא חיונית בעת ניתוק רקמות או העברת תאים שכבר נמצאים בהשעיה. כדי להפחית את הנזק הפיזי לתאים מכוחות גזירה, חשוב פיפטה בעדינות ולאט במהלך ההשעיה מחדש של התא. מומלץ בדרך כלל להשתמש טיפים פיפטה רחב נשא. אם משתמשים בטיפים סטנדרטיים, חשוב במיוחד להשעיית תאי פיפטה בעדינות, כדי למנוע כוחות גזירה שאחרת היו פוגעים בתאים. באמצעות מסנני תאים הוא בלתי נמנע בפרוטוקול זה, עם זאת, ריכוז התא יכול לרדת על ידי 20% או יותר, מלווה אובדן נפח של 100 μL או יותר. אנו ממליצים כי ריכוז התא ייקבע לאחר מאמץ כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת.
ב cytometry זרימה, פקדי FMO לספק מידה של רקע עקב דימום דרך האות מפסגות פליטה חופפות. הם אינם מדד של כריכת נוגדנים לא ספציפית, או כתמי רקע שעשויים להיות נוכחים כאשר נוגדן נכלל בערוץ זה. כדי להסביר את איגוד הנוגדנים הלא ספציפי, יש לכלול בקרות isotype מתאימות; עבור כתמי הרקע, יש לכלול פקדים שליליים. יחד, פקדים אלה מבטיחים מדידה מדויקת של אוכלוסיות תאים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (R01 DK077195 כדי R.M.A, R01 DK104641 כדי R.M.A ו D.R.B). אנו מכירים בתשומת לב רבה מד”ר סטיוארט אורקין במחלקה להמטולוגיה/אונקולוגיה, בית החולים לילדים בבוסטון, המחלקה לרפואת ילדים, בית הספר לרפואה של הרווארד והמכון לסרטן דנה פרבר. אנו גם מכירים בתמיכתם של קייל קוסטה בטיפול שלאחר הניתוח בעכברים, מרי תגלינטי וד”ר חביבאללה שוג’איזאדי (מעבדת ד”ר יאנג שי, המחלקה לרפואת ילדים, המחלקה לרפואת תינוקות, המחלקה לרפואת תינוקות, המחלקה לרפואת תינוקות, בית החולים לילדים בבוסטון, בית הספר לרפואה של הרווארד) לסיוע טכני ודיונים מועילים.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |