此协议的目标是将优化的组织分离协议应用于脊髓损伤的鼠标模型,并验证通过流细胞学进行单细胞分析的方法。
我们描述了脊髓损伤在小鼠的实施,以引起脱毛器括约肌发育不良,功能性膀胱出口阻塞,以及随后的膀胱壁改造。为了促进评估非损伤控制和脊髓损伤小鼠膀胱壁的细胞组成,我们开发了一个优化的分离方案,支持高细胞存活率,并允许通过流细胞检测离散亚人口。
脊髓损伤是由胸脊髓的完全转位造成的。在组织收获时,动物在深度麻醉下注入磷酸盐缓冲盐水,膀胱被收获到Tyrode的缓冲液中。组织在消化缓冲区孵化之前切碎,消化缓冲区根据小鼠膀胱的胶原蛋白含量进行优化,通过对公开的基因表达数据库的询问确定。单细胞悬浮后,通过流细胞学分析材料,以评估细胞存活率、细胞数和特定子群落。我们证明,该方法产生细胞群超过90%的生存能力,并有力地表示细胞的间质和上皮起源。这种方法将能准确分析小鼠膀胱和其他器官中的离散细胞类型。
正常尿囊功能的扰动会导致许多人生活质量下降。为了更好地了解损伤或疾病如何破坏膀胱的正常功能,重要的是要探索膀胱内细胞的正常生物状态,以及它们在实验扰动下是如何变化的。然而,迄今为止,尿囊内的特定细胞群以及它们如何随损伤而变化,其特征尚未完全确定。
单细胞剖析方法,如流细胞切除术或单细胞RNA测序(scRNA-seq),有可能揭示膀胱内的特定细胞类型。然而,要使这些方法成为信息性组织,必须以不影响收获组织的生存能力、基因表达和代表性细胞群百分比的方式进行消化。采用酶分聚的方案可以通过不分青红皂白的蛋白酶活性1影响表面标记表达,从而通过流细胞学影响细胞识别,而分离过程本身可导致立即早期基因的诱导,正如范登布林克及其同事最近描述的那样。作者表明,虽然受分离影响的亚人口很少,但由于即时早期基因的表达水平较高,它可能会在批量表达研究中触发强烈的污染信号。此外,分离协议的持续时间影响了某些亚种群所特有的基因的体积表达水平。因此,在不考虑分离协议影响的情况下生成的单个细胞数据集可能会产生分离方法产生的基因表达变化,而不是基础生物学。这些观察表明,发表的单细胞转录经济学数据应谨慎解释,结果应通过独立方法进行验证。
虽然,苛刻和冗长的分离方法可能会改变细胞2中的基因表达:有效分离细胞对于准确表示存在的细胞类型至关重要。由于膀胱是一个复杂的器官,由多种细胞类型组成,因此一些群体,如尿道细胞或频闪细胞,可能相对代表不足,而其他细胞类型,如成纤维细胞存在于细胞外基质内,可能难以分离。分离变得更加具有挑战性,如果膀胱经历了重大的改造和纤维化,如在脊髓损伤3,4或膀胱出口障碍5,6观察到。
在这里,我们描述了脊髓损伤小鼠膀胱下游单细胞分析的优化组织分离方法。使用流细胞学,我们比较了四种酶消化方案,它们能够产生单个细胞悬浮,支持细胞存活率,并保持细胞群的正确比例。基于这一分析,我们得出结论,尽量减少细胞死亡、细胞聚集物、非细胞核酸和下游分析的潜在抑制剂对于实现高质量的数据至关重要。
此处描述的鼠脊髓损伤模型提供了一种可重复的方法,由于膀胱收缩和外部尿道括约肌松弛之间失去协调,可产生功能性膀胱出口阻塞。这反过来又唤起了膀胱壁的深刻改造,早在受伤后2周,其特点是扩大尿道和光滑的肌肉隔间。在啮齿动物中实施SCI模型的关键步骤包括:(i) 在脊柱休克期间严格注意手动膀胱表达,在受伤后10-u201214天;(二) 营养丰富,以尽量减少体重减轻:(三) 缓解尿液烫伤的可能性,特别是用于超越反射失效返回的实验。该模型的局限性包括:在瞬时血尿期间,小鼠可能从血栓中排出尿道,另外,在手术后逆行射精后,来自精液库古鲁姆的雄性小鼠中。
此处描述的组织分离方法说明了考虑实验侮辱引起的组织结构变化的重要性,在这种情况下,SCI 之后的重大组织重塑可能会影响下游分析。随着单细胞分析的增加,必须确保在基因表达中观察到的差异不仅仅是分离引起的扰动的结果,而是真正代表与疾病模型相关的潜在生物变化。使用公开的表达数据使我们能够修改消化缓冲器的配方,以确保细胞外矩阵的有效消化,同时最大限度地提高可行性。在未来的应用中可以考虑的其他修改包括添加actinomycin D,以阻止对分离协议15敏感的即时早期基因的转录。
在分离组织或转移已经处于悬浮状态的细胞时,管道技术至关重要。为了减少剪切力对细胞的物理损害,在细胞重新悬念期间轻轻和缓慢地使用移液器非常重要。一般建议使用宽孔移液器提示。如果使用标准提示,则轻轻使用移液器细胞悬架,以避免剪切力,否则会损害细胞,这一点尤为重要。然而,使用细胞过滤器是不可避免的,但是,细胞浓度可以下降20%或更多,伴随着100μL或以上的体积损失。我们建议在紧张后确定细胞浓度,以确保精确的细胞计数。
在流细胞学中,FMO 控制提供背景的测量,因为信号从重叠的发射峰值出血。它们不是非特异性抗体结合的量度,也不是当抗体包含在该通道中时可能存在的背景染色。要考虑非特异性抗体结合,必须包括适当的同型控制:对于背景染色,需要包括负控制。综合起来,这些控制确保准确测量细胞群。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院(R01 DK077195至R.M.A、R01 DK104641至R.M.A和D.R.B)的赠款支持。我们感谢斯图亚特·奥金博士在血液学/肿瘤学系、波士顿儿童医院、儿科系、哈佛医学院和达纳-法伯癌症研究所提供的宝贵意见。我们还感谢凯尔·科斯塔、玛丽·塔利恩蒂和哈比巴拉·肖贾伊萨迪博士(儿科部杨石博士实验室、新生儿医学部、儿科部、新生儿医学部、波士顿儿童医院、哈佛医学院)在技术援助和有益讨论方面给予的支持。
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |