이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.
우리는 분리기 괄약근 dyssynergia, 기능성 방광 출구 방해 및 후속 방광 벽 리모델링을 유도하기 위하여 마우스에 있는 척수 손상의 구현을 기술합니다. 비부상 조절및 척수 손상마우스에서 방광벽의 세포구성평가를 용이하게 하기 위해 높은 세포 생존가능성을 지원하고 유동 세포측정에 의한 이산 하위집단의 검출을 가능하게 하는 최적화된 해리 프로토콜을 개발했습니다.
척수 손상은 흉부 척수의 완전한 transection에 의해 생성됩니다. 조직 수확 시, 동물은 깊은 마취 하에 인산염 완충식식염으로 침투하고 방광은 티로드의 완충제로 수확됩니다. 조직은 공개적으로 이용 가능한 유전자 발현 데이터베이스의 심문에 의해 결정된 마우스 방광의 콜라겐 함량에 기초하여 최적화된 소화 완충제에서 인큐베이션 하기 전에 다진다. 단일 세포 현탁액의 생성에 이어, 물질은 세포 생존가능성, 세포 수 및 특정 하위 집단의 평가를 위한 유동 세포측정에 의해 분석된다. 우리는 이 방법이 90% 이상의 생존력을 가진 세포 집단을 산출하고, 중간엽 및 상피 기원의 세포의 견고한 표현을 산출한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 마우스 방광 및 잠재적으로 다른 장기에 있는 개별적인 세포 모형의 정확한 다운스트림 분석을 가능하게 할 것입니다.
정상적인 오줌 방광 기능의 동요는 많은 개별을 위한 삶의 감소질로 이끌어 낼 수 있습니다. 부상이나 질병이 정상적인 방광 기능을 탈선하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서는 방광 내의 세포의 정상적인 생물학적 상태와 실험적 동요 하에서 어떻게 변화하는지 조사하는 것이 중요합니다. 그러나 현재까지 오줌 방광 내에 거주하는 특정 세포 인구와 부상으로 어떻게 변하는지 는 불완전하게 특징지어지고 있습니다.
유동 세포형 또는 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 같은 단일 세포 프로파일링 방법은 방광 내의 특정 세포 유형에 빛을 비출 가능성이 있다. 그러나, 유익한 조직이 되는 이러한 접근법은 수확된 조직의 생존력, 유전자 발현 및 대표적인 세포 집단 비율에 영향을 미치지 않는 방식으로 소화되어야 한다. 효소 적 분리를 사용하는 프로토콜은 무차별 적인 프로테아제 활성1을통해 표면 마커 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 세포 측정에 의한 세포 식별에 영향을 미치는 반면, 해리 과정 자체는 반 덴 브링크 및 동료2에의해 최근에 설명된 바와 같이 즉각적인 초기 유전자의 유도로 이어질 수 있다. 저자는 해리에 영향을 받은 하위 인구가 작더라도, 즉각적인 초기 유전자의 높은 발현 수준 때문에 대량 발현 연구 결과에 있는 강한 오염 신호를 시작할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 또한, 해리 프로토콜의 지속 기간은 일부 하위 집단에 고유한 것으로 나타난 유전자의 대량 발현 수준을 검출하는 데 영향을 미쳤다. 따라서, 해리 프로토콜의 영향을 고려하지 않고 생성된 단일 세포 데이터 세트는 근본적인 생물학과는 반대로 해리 방법으로부터 발생하는 유전자 발현 변화를 산출할 수 있다. 이러한 관측에 따르면 발표된 단일 세포 전사 데이터는 주의해서 해석되어야 하며, 그 결과는 독립적인 방법으로 검증되어야 합니다.
비록, 가혹하고 긴 해리 방법은 세포2에서유전자 발현을 바꿀 수 있습니다; 세포의 효과적인 격리는 존재하는 세포 모형의 정확한 표현을 얻기 위하여 필수적입니다. 방광은 다중 세포 모형을 포함하는 복잡한 기관이기 때문에, 비뇨기과 또는 기질 세포와 같은 몇몇 인구는 세포외 매트릭스 안에 존재하는 섬유아세포와 같은 그밖 세포 모형이 상대적으로 과소 표현될 수 있고 격리하기 어려울 수 있습니다. 방광이 척수 손상3,4 또는 방광 출구 방해5,6에서관찰되는 것과 같은 상당한 리모델링 및 섬유증을 겪은 경우 해리는 더욱 어려워진다.
여기서는 척수 손상 마우스 방광에서 하류 단일 세포 분석을 위한 최적화된 조직 해리 방법을 설명합니다. 유동 세포측정을 사용하여, 우리는 단 하나 세포 현탁액을 산출하고, 세포 생존가능성을 지원하며, 세포 집단의 정확한 비율을 유지하는 그들의 능력을 위한 4개의 효소 소화 프로토콜을 비교했습니다. 이 분석에 기초하여, 우리는 세포 사멸, 세포 응집체, 비 세포 핵산 및 다운스트림 분석의 잠재적억제제를 최소화하는 것이 고품질 데이터를 달성하는 데 중요하다는 결론을 내립니다.
여기에 설명된 마우스 척수 손상 모델은 방광 수축과 외부 요도 괄약근 이완 사이의 협착로 인한 기능성 방광 출구 장애물을 만드는 재현 가능한 방법을 제공한다. 이것은 차례로 비뇨기과 매끄러운 근육 구획의 확장에 의해 특징지어진 상해 후에 2 주 초에 방광 벽의 심오한 리모델링을 연상시킵니다. 설치류에서 SCI 모델의 구현에 중요한 단계는 (i) 부상 후 10\u201214 일 동안 계속되는 척추 충격의 기간 동안 수동 방광 발현에 엄격한 주의를 포함한다; (ii) 체중 감량을 최소화하기 위한 영양 농축; 및 (iii) 소변 비열의 반환을 넘어 확장 실험에 대한 특히 소변 확장에 대한 잠재력의 완화. 모델의 한계는 일시적인 혈뇨 기간 동안 혈전에서 마우스에 요도 폐색에 대한 잠재력을 포함, 그리고 추가로 수술 후 역행 사정 다음 정액 응고에서 남성 마우스에서.
여기에 설명된 조직 해리 접근법은 실험적 모욕에서 발생하는 조직의 구조적 변화를 고려하는 것의 중요성을 보여 주며, 이 경우 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 SCI에 따라 중요한 조직 리모델링이 있을 수 있다. 단일 세포 분석의 증가로 유전자 발현에서 관찰된 차이는 단순히 해리 유발 된 동요의 결과가 아니라 질병 모델과 관련된 근본적인 생물학적 변화를 진정으로 대표하는 것이 중요합니다. 공개적으로 이용 가능한 식 데이터의 사용은 우리가 생존가능성을 극대화하면서 세포외 매트릭스의 효과적인 소화를 보장하기 위해 소화 버퍼의 공식을 수정할 수 있었습니다. 향후 응용 분야에서 고려될 수 있는 추가 수정은 해리프로토콜(15)에민감한 즉각적인 초기 유전자의 전사를 중단하기 위해 actinomycin D의 첨가를 포함한다.
파이프팅 기술은 조직을 해리하거나 이미 현탁액에있는 세포를 전송 할 때 중요합니다. 전단력으로 인한 세포의 물리적 손상을 줄이기 위해 세포 재서스펜션 중에 부드럽고 천천히 피펫하는 것이 중요합니다. 일반적으로 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 표준 팁을 사용하는 경우 세포를 손상시키는 전단 력을 피하기 위해 피펫 셀 서스펜션을 부드럽게 피하는 것이 특히 중요합니다. 이 프로토콜에서는 세포 스트레이너를 사용하는 것이 불가피하지만, 세포 농도는 100 μL 이상의 부피 손실과 함께 20% 이상 감소할 수 있다. 정확한 세포 수를 보장하기 위해 긴장 후 세포 농도를 결정하는 것이 좋습니다.
흐름 세포면에서 FMO 컨트롤은 중복방출 피크에서 신호의 출혈로 인해 배경의 측정을 제공합니다. 그(것)들은 항체가 그 채널에 포함될 때 존재할 수 있는 비특이적인 항체 결합, 또는 배경 염색의 측정이 아닙니다. 비특이적 항체 결합을 고려하기 위해, 하나는 적절한 등류형 제어를 포함해야 한다; 배경 염색의 경우 음수 컨트롤을 포함해야 합니다. 이러한 컨트롤을 종합하여 세포 집단을 정확하게 측정할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 보건원 (R01 DK077195에서 R.M.A, R01 DK104641에서 R.M.A 및 D.R.B)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 혈액학/ 종양학, 보스턴 아동 병원, 소아과 부, 하버드 의과 대학 및 다나 파버 암 연구소의 스튜어트 오킨 박사로부터 귀중한 의견을 인정합니다. 우리는 또한 마우스의 수술 후 치료에 카일 코스타에서 지원을 인정, 메리 타글리엔티와 박사 하비발라 Shojaeisadi (박사 양시 연구소, 소아과의 학과, 신생아 의과, 소아과의 학과, 신생아 의과, 보스턴 어린이 병원, 하버드 의과 대학) 기술 지원 및 도움이 토론을 위해.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |