O objetivo deste protocolo é aplicar um protocolo otimizado de dissociação tecidual a um modelo de camundongo de lesão medular e validar a abordagem para análise de célula única por citometria de fluxo.
Descrevemos a implementação de lesão medular em camundongos para provocar dissynergia detrusor-esfíncter, uma obstrução funcional da saída da bexiga e posterior remodelação da parede da bexiga. Para facilitar a avaliação da composição celular da parede da bexiga no controle não ferido e camundongos lesados na medula espinhal, desenvolvemos um protocolo de dissociação otimizado que suporta alta viabilidade celular e permite a detecção de subpopulações discretas por citometria de fluxo.
A lesão medular é criada por transeção completa da medula espinhal torácica. No momento da colheita de tecidos, o animal é perfundido com soro fisiológico tamponado com fosfato sob anestesia profunda e bexigas são colhidas no tampão de Tyrode. Os tecidos são picados antes da incubação no tampão de digestão que foi otimizado com base no conteúdo de colágeno da bexiga do rato, conforme determinado pelo interrogatório de bancos de dados de expressão genética disponíveis publicamente. Após a geração de uma única suspensão celular, o material é analisado por citometria de fluxo para avaliação da viabilidade celular, número celular e subpopulações específicas. Demonstramos que o método produz populações celulares com maior viabilidade de 90%, e representação robusta de células de origem mesenquimal e epitelial. Este método permitirá uma análise precisa a jusante de tipos de células discretas na bexiga do rato e, potencialmente, em outros órgãos.
Perturbações da função normal da bexiga urinária podem levar à diminuição da qualidade de vida de muitos indivíduos. Para obter uma melhor compreensão de como lesões ou doenças descarrilam a função normal da bexiga, é importante sondar o estado biológico normal das células dentro da bexiga e como elas mudam sob perturbação experimental. Até hoje, porém, as populações celulares específicas que residem dentro da bexiga urinária, e como mudam com lesões, têm sido incompletamente caracterizadas.
Métodos de criação de perfil de células únicas, como citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) têm o potencial de lançar luz sobre tipos de células específicas dentro da bexiga. No entanto, para que essas abordagens sejam um tecido informativo deve ser digerido de forma que não afete a viabilidade, a expressão genética e os percentuais representativos da população celular do tecido colhido. Protocolos que empregam desagregação enzimática podem impactar a expressão do marcador de superfície através da atividade de protease indiscriminada1, impactando assim a identificação celular por citometria de fluxo, enquanto o processo de dissociação em si pode levar à indução de genes precoces imediatos, como descrito recentemente por Van den Brink e colegas2. Os autores mostraram que, embora a subpopulação afetada pela dissociação fosse pequena, poderia desencadear um forte sinal contaminante em estudos de expressão em massa devido aos altos níveis de expressão de genes precoces imediatos. Além disso, a duração do protocolo de dissociação afetou os níveis de expressão em massa detectados de genes mostrados exclusivos de algumas subpopulações. Assim, conjuntos de dados unicelulares gerados sem contabilizar o impacto do protocolo de dissociação podem produzir alterações na expressão genética decorrentes do método de dissociação, em oposição à biologia subjacente. Essas observações sugerem que os dados de transcrição de células únicas publicados devem ser interpretados com cautela, e que os resultados devem ser validados por métodos independentes.
Embora, métodos de dissociação severos e demorados possam alterar a expressão genética nas células2; o isolamento efetivo das células é essencial para obter uma representação precisa dos tipos celulares presentes. Uma vez que a bexiga é um órgão complexo composto por vários tipos de células, algumas populações como células urteliais ou estromais podem ser relativamente sub-representadas, enquanto outros tipos de células, como os fibroblastos, existem dentro da matriz extracelular e podem ser desafiadoras para se isolar. A dissociação torna-se ainda mais desafiadora se a bexiga tiver sofrido remodelação significativa e fibrose, como a observada na lesão medular3,4 ou obstrução da saída da bexiga5,6.
Aqui, descrevemos um método otimizado de dissociação de tecido para análise de células únicas a jusante na bexiga do rato lesado pela medula espinhal. Usando citometria de fluxo, comparamos quatro protocolos de digestão enzimática por sua capacidade de produzir uma única suspensão celular, suportar a viabilidade celular e manter a proporção correta das populações celulares. Com base nesta análise, concluímos que minimizar a morte celular, os agregados celulares, os ácidos nucleicos não celulares e os potenciais inibidores da análise a jusante são fundamentais para alcançar dados de alta qualidade.
O modelo de lesão medular do camundongo descrito aqui fornece um método reprodutível para criar uma obstrução funcional da saída da bexiga devido à perda de coordenação entre a contração da bexiga e o relaxamento do esfíncter uretral externo. Isso, por sua vez, evoca uma profunda remodelação da parede da bexiga logo após 2 semanas após a lesão caracterizada pela expansão dos compartimentos musculares urotelial e liso. As etapas críticas na implementação do modelo SCI em roedores incluem (i) atenção rigorosa à expressão manual da bexiga durante o período de choque espinhal que se segue para 10\u201214 dias após a lesão; (ii) enriquecimento nutricional para minimizar a perda de peso; e (iii) mitigação do potencial de escaldação de urina particularmente para experimentos que vão além do retorno do vazio reflexo. As limitações do modelo incluem o potencial de oclusão uretral em camundongos a partir de coágulos sanguíneos durante o período de hematuria transitória, e adicionalmente em camundongos machos de coagulo de semen após ejaculação retrógrada após a cirurgia.
A abordagem de dissociação tecidual descrita aqui ilustra a importância de considerar mudanças estruturais nos tecidos decorrentes do insulto experimental, neste caso uma remodelação significativa do tecido após a SCI que pode influenciar as análises a jusante. Com o aumento das análises de células únicas, é fundamental garantir que as diferenças observadas na expressão genética não sejam simplesmente resultado de perturbações induzidas por dissociação, mas sejam verdadeiramente representativas das mudanças biológicas subjacentes relevantes para o modelo da doença. O uso de dados de expressão disponíveis publicamente nos permitiu modificar a formulação de buffers de digestão para garantir uma digestão eficaz da matriz extracelular, maximizando a viabilidade. Modificações adicionais que poderiam ser consideradas em aplicações futuras incluem a adição de actinomicina D, para interromper a transcrição de genes iniciais imediatos sensíveis ao protocolo de dissociação15.
A técnica de pipetação é crucial ao dissociar tecido ou transferir células que já estão em suspensão. Para reduzir os danos físicos às células das forças de tesoura, é importante pipeta suavemente e lentamente durante a ressuspensão celular. É geralmente recomendado usar pontas de pipeta largas. Se usar as pontas padrão, é particularmente importante que as suspensões de células pipetas suavemente evitem forças de tesoura que de outra forma danificariam as células. O uso de filtros celulares é inevitável neste protocolo, no entanto, a concentração celular pode diminuir em 20% ou mais, acompanhada de uma perda de volume de 100 μL ou mais. Recomendamos que a concentração celular seja determinada após o esforço para garantir uma contagem precisa de células.
Na citometria de fluxo, os controles de FMO fornecem uma medida de fundo devido à sangria do sinal de picos de emissões sobrepostos. Eles não são uma medida de ligação de anticorpos inespecíficos, ou coloração de fundo que pode estar presente quando um anticorpo é incluído nesse canal. Para explicar a vinculação de anticorpos nãopecíficos, é preciso incluir controles isótipos apropriados; para a coloração de fundo, é preciso incluir controles negativos. Juntos, esses controles garantem uma medição precisa das populações celulares.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A e D.R.B). Reconhecemos informações valiosas do Dr. Stuart Orkin na Divisão de Hematologia/Oncologia, Hospital Infantil de Boston, Departamento de Pediatria, Harvard Medical School e no Instituto de Câncer Dana-Farber. Também reconhecemos o apoio de Kyle Costa no cuidado pós-operatório de camundongos, Mary Taglienti e Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Hospital Infantil de Boston, Harvard Medical School) para assistência técnica e discussões úteis.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |