Подавление роста клетки множественной миеломы в Vivo, одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ)-доставлены антисмысловых Oligos MALAT1
Summary
Эта рукопись описывает синтез одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ)-конъюгированных MALAT1 антисмысловых gapmer ДНК олигонуклеотида (ОУНТ анти MALAT1), который демонстрирует надежную доставку ОУНТ и мощный терапевтический эффект анти MALAT1 в vitro и in vivo. Методы, используемые для синтеза, модификация, спряжение, и описаны инъекции ОУНТ анти MALAT1.
Abstract
Одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) является новый тип наночастиц, который был использован для доставки нескольких видов наркотиков в клетки, такие как белки, олигонуклеотиды и синтетических наркотиков мелкомолекулярных. ОУНТ имеет настраиваемые размеры, большой поверхностный площади и можно гибко привязать с наркотиками через различные модификации на его поверхности; Таким образом это идеальная система для транспортировки наркотиков в клетки. Длиной некодирующих РНК (lncRNAs) являются кластер некодирующей РНК больше чем 200 nt, который нельзя преобразовать в белок, но играют важную роль в биологических и патофизиологических процессов. Стенограмма аденокарциномы легкого с метастазами связанные 1 (MALAT1) является весьма сохраняется lncRNA. Было продемонстрировано, что более высокие уровни MALAT1 связаны с плохим прогнозом различные виды рака, в том числе множественной миеломы (мм). Мы показали, что MALAT1 регулирует ДНК клеток и ремонт смерти в мм; Таким образом MALAT1 может рассматриваться как терапевтические мишенью для мм. Однако эффективной доставки антисмысловых oligo подавляют/нокдаун MALAT1 в естественных условиях по-прежнему является проблемой. В этом исследовании мы изменить ОУНТ с ПЭГ-2000 и спряжения oligo анти MALAT1 к нему, проверить доставку этого соединения в пробирке, вставляют его внутривенно распространение модель мыши мм и наблюдать значительное торможение прогрессирования мм, который указывает что ОУНТ является идеальным доставки Трансфер для анти MALAT1 gapmer ДНК.
Introduction
ОУНТ является роман Наноматериал, которые могут доставить различные виды наркотиков, таких как белки, малые молекулы и нуклеиновые кислоты, стабильно и эффективно с идеальной переносимость и минимальная токсичность в пробирке1 и в естественных условиях2. Функционализированных ОУНТ имеет большой биосовместимость и растворимость в воде, может использоваться как трансфер для небольших молекул и может нести их проникнуть в клеточной мембраны3,4,5.
lncRNAs-группа РНК (> 200 nt), трансляции из генома к мРНК, но не могут быть переведены с белками. Увеличения доказательств показал, что lncRNAs участвуют в регуляции генов выражение6 и участвуют в инициации и прогрессирования большинства видов рака, включая мм7,8,9. MALAT1 это-обогащенный некодирующей Стенограмма 2 (NEAT2) и весьма сохранены lncRNA10. MALAT1 первоначально отражаются в метастатических не небольшие клеток легких рака легкого (НМРЛ)11, но был оверэкспрессировали в многочисленных опухолей5,12,13; Это один из наиболее сильно выраженным lncRNAs и коррелирует с плохим прогнозом в мм8,14. Уровень экспрессии MALAT1 значительно выше в роковой курс интрамедуллярный мм пациентов по сравнению с теми только диагнозом15мм.
В предыдущем исследовании, мы подтвердили, что анти MALAT1 oligos энергично привести к повреждение ДНК и апоптоз в16 мм с помощью gapmer антисмысловых олигонуклеотидов ДНК ориентации MALAT1 (анти MALAT1) в клетках мм. Gapmer ДНК состоит из антисмысловых ДНК и соединены 2′-OMe-РНК, которые могли бы побудить MALAT1 расщепление H РНКазы раз связана деятельность17. В естественных условиях доставки эффективность антисмысловых oligos по-прежнему ограничивает его клинического использования.
Чтобы проверить доставку эффект ОУНТ для анти MALAT1 gapmer oligos, gapmer анти MALAT1, что ДНК конъюгированных с DSPE-PEG2000-Амин функционализированных ОУНТ. ОУНТ анти MALAT1 затем вводят внутривенно в модель распространения мыши мм; поразительное ингибирование наблюдается после четырех сеансов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Доказательств показал, что lncRNAs принимают участие в регуляции многочисленных физиологические и патофизиологические процедур в раках, включая мм7,8,9; они имеют потенциал, чтобы быть направлены для лечения рака, которые могут быть реализ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят proteomic Лернер научно-исследовательский институт, геномные и изображений ядра за их помощь и поддержку. Финансирование: Эта работа была финансовой поддержке гранта NIH/NCI R00 CA172292 (для J.J.Z.) и начальных средств (для J.J.Z.) и клинические и поступательного науки совместных (АОЗТ) дело Вестерн Резерв университета Core использования пилот гранта (J.J.Z.). Эта работа использовали Конфокальный микроскоп Leica SP8, который был приобретен с финансирования из национальных институтов здравоохранения SIG Грант 1S10OD019972-01.
Materials
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT – 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC – 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG – 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG – 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O’Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D’Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
