Burada biz yetişkin zebra balığı (Danio rerio) DNA tabanlı aşı ile Bağışıklama için bir iletişim kuralı tanımlamak ve doğrulama başarılı olay göstermektedir. Bu yöntem çeşitli enfeksiyon modellerinde aşısı adayların preklinik tarama için uygundur.
DNA tabanlı aşı ilgi son iki yılda artmıştır. DNA aşı bir dizi seçili bir antijen veya bir terzi ve güvenli tasarımı’nı etkinleştirir bir plazmid antijenleri bir birleşimini klonlama üzerinde temel alır. DNA aşıları yönetim ana hücreleri humoral ve hücre-aracılı bağışıklık yanıtı teşvik antijenleri ifade için yol açar. Bu rapor içine pCMV-EGFP plazmid, Yetişkin zebra balığı bağışıklama alımını artırmak için aşı aday tarafından kas içi mikroenjeksiyon ve sonraki Elektroporasyon ile antijen dizileri klonlama için bir protokolünü açıklar. Aşı antijenleri yeşil flüoresan protein (GFP) ifade edilir-antijen ifade UV canlı balık ve ifade düzeyleri füzyon protein miktar ELISA ile de olarak ışığı altında onay sağlar füzyon protein bir western blot analizi ile algılama. Koruyucu etkisi olan aşı adayların Mycobacterium marinum beş hafta postvaccination, balıkla bulaşmasını tarafından test dört hafta sonra qPCR ile bakterilerin miktar izledi. Memeli preklinik tarama modellerle karşılaştırıldığında, bu yöntem Mikobakteriyel bulaşmasına karşı yeni aşı DNA tabanlı adayların ön elemeyi için düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Yöntemi daha da çeşitli bakteriyel ve viral hastalıklara karşı aşılar DNA tabanlı eleme için uygulanır.
İlk DNA aşı çalışmaları 1990’larda1‘ gerçekleştirilen ve o zamandan beri DNA aşıları çeşitli bulaşıcı hastalıklar, kanser, otoimmünite ve anti2karşı test edilmiştir. Memelilerde, bir DNA aşı karşı Batı Nil virüsü at ve köpek sözlü melanom tedavi kanser aşısı lisanslı ama şu anda klinik kullanımı2‘ bunlar değil. Memeli çalışmaları tarafından uyarılmış faiz yanı sıra DNA aşı çiftlik balık viral hastalıklara karşı bağışıklık için kullanışlı bir yol çıktı. Balık enfeksiyöz hematopoietik nekroz virüsü (IHNV) karşı bir aşı 2005 yılından bu yana ticari kullanımı içinde oldu ve son zamanlarda lisanslı3enfeksiyöz pankreatik nekroz virüsü (IPNV) karşı bir aşı yapıldı. Ayrıca, balık patojenlere karşı birkaç DNA aşıları geliştirilmektedir.
Geleneksel aşılar kez Inaktif veya canlı zayıflatılmış patojenler içerdiğinden, onlar hastalık2verici potansiyel bir riski. DNA aşıları, buna karşılık, bu riski önlemek, bakteriyel veya viral antijenler, tercihan–dan tüm patojen2,4kodlama plazmid yönetimini temel alan gibi. DNA’sı aşılar aşı antijenleri hassas tasarım ve antijen kombinasyonları ve adjuvan esnek formülasyonu bir tek aşı yapı5‘ te sağlar DNA rekombinasyon teknikleri ile üretilmektedir. Ayrıca, DNA aşıları üretimi daha hızlı, daha kolay ve daha maliyet-etkin aşı aday amaçlar eleme, aynı zamanda, örneğin, pandemik salgın durumunda önemli bir avantajı olan, protein bazlı rekombinant aşı daha 2.
Balık, DNA aşıları için en yaygın yönetim yolları mayi, kas içi ve sözlü3,6,7, memelilerde ise, subkutan ve ek seçenekler2intradermal yolları vardır. Bir kas içi enjeksiyon sonra administrated DNA plazmid yönetim sitesindeki hücreleri girin (Örn., çoğunlukla miyositler, aynı zamanda yerleşik antijen sunan hücreler [ZPT]). Transfected hücre oranı önemli ölçüde Elektroporasyon2,8tarafından artırılabilir. Hücre girdikten sonra bazı plazmid DNA çekirdeği, plazmid tarafından kodlanan genlerin transkripsiyonu2nerede girer. Bu protokol için biz güçlü bir her yerde organizatörü ökaryotik ifade9için en iyi duruma getirilmiş olan pCMV-EGFP plazmid kullanmaktadır. Bu yapıyı antijenleri bir GFP bir füzyon proteini olarak çevrilir. GFP başarılı bir aşılama ve doğru antigen ürün onayı ile floresan mikroskop canlı balık tarafından antijen ifade görselleştirme basit sağlar.
Memelilerde, DNA aşıları bağışıklık yanıtı transfected hücre türleri2,5bağlı olarak farklı türlerde uyarmak gösterilmiştir. Transfected miyositler antijenleri hücre dışı uzaya salgılar veya hücre ölümü bırakın ve ZPT tarafından yuttu antijenleri daha sonra MHC kompleksi II molekülleri2üzerinde sunulur. Bu CD4 ve CD8 T hücre yanıtlarının, özellikle, B hücre yanıt-e doğru2,5,10ek olarak tetikler. Antijen sunumu içinde onların işbölümü daha az iyi anlaşılan11henüz balıkların, dendritik hücreler (DCs), yanı sıra T ve B lenfositler, tespit edilmiştir. Zebra balığı DCs, ancak, onların memeli karşıtları12ile korunmuş fenotipik ve fonksiyonel özellikleri paylaşan gösterilmiştir. Ayrıca, DNA aşı benzer bağışıklık yanıtı balık ve memeliler, T ve B hücre yanıt-e doğru6,13,14,15,16 dahil olmak üzere temin için gösterilen .
Larva ve yetişkin zebra balığı balık M. marinum enfeksiyon modeli bu protokolü17,18,19‘,20 kullanılan tüberküloz gibi modeli farklı bulaşıcı hastalıklar için yaygın olarak kullanılan ,21,22. İle karşılaştırıldığında memeli canlılar, zebra balığı avantajları arasında küçük büyüklük, hızlı tekrarlanabilirlik ve giderleri23konut düşük. Bu yönleriyle zebra balığı bir ideal hayvan büyük ölçekli preklinik tarama çalışmaları roman aşı ve ilaç bileşikler23,24,25için modele.
Bu protokol için aday mycobacteriosis karşı yetişkin zebra balığı DNA tabanlı aşılama tarafından değerlendirilip nasıl roman Aşı antijen açıklar. İlk olarak, nasıl antijenleri aşı plazmit ve sonraki Elektroporasyon kas içi enjeksiyon için detaylı bir protokolü tarafından kas içine takip pCMV-EGFP ifade plazmid içine klonlanır açıklar. Her antijen ifade floresans mikroskobu bir haftalık postimmunization tarafından onaylanır. Antijen adaylar etkinliğini sonra deneysel olarak M. marinumile aşı balık hastalık tarafından test edilmiştir.
DNA tabanlı aşılar ile yetişkin zebra balığı immunizing yordam bazı teknik uzmanlık gerektirir. Bile deneyimli bir araştırmacı için tek bir balık telkih yaklaşık 3 dakika hazırlıkları hariç, alır. Böylece, en fazla yaklaşık 100 balık bir gün içinde aşı. 100’den fazla balık deneme için gerekliyse, aşı 3 gün arasında ayrılabilir. Deneme kalitesine ek olarak, Balık işleme ve bağışıklama gerçekleştirmek için researcher(s) yeterli eğitim balık refahı esastır. Bu deneyler ve deneyler yürüten personel için gerekli nitelikleri planlama balık, konut için geldiğinde yerel yasal ve hayvan refahı kurallar ve ilkeler takip ettiğinizden emin olun.
Özetle, bağışıklama protokolündeki komplikasyonları önlemek için çeşitli kritik adımlar vardır. Başarılı bağışıklama için emin 1) aşı için balık sağlıklı ve yeterli yaş ve boyutu (daha çocuksu balık bağışıklama aşağı ölçeklendirme-aşı birim ve Elektroporasyon ayarları gerektirebilir); 2) balık düzgün Hayır ile anestezi %0.02 3-aminobenzoic asit etil ester, daha güçlü ve onlar tüm prosedürü imzalat kalır (anestezi tutulan balık sağlamak mümkün olduğunca kısa); 3) sünger yastık düzgün ıslatılır; 4) sıvı her darbe pnömatik pompası enjekte edilir ve eğer değil, darbe uzunluk ayarlanır (iğne y ekseni boyunca hafifçe geriye doğru çekerek yardımcı olabilir); 5) orada hiçbir hava kabarcıkları ile aşı çözüm; 6) Elektroporasyon ayarları ve gerçek darbe gerilimi ve uzunluğu doğru; 7) elektrotlar Deri Hasari Elektroporasyon ücreti (sırasında çoğalmasıyla, nazik elektrotlar başvurun ile balık ve hemen kurtarma tankı içine balık çoğalmasıyla sonra serbest tutun) neden olmaz.
Balık çoğalmasıyla kurtarma tank sonra izlemek ve rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir balık ötenazi için önemlidir. Ayrıca, bu yordamı akıcı bir iş akışı sağlamak için bir büyük ölçekli deney başlamadan önce uygulama gereklidir. Mümkünse, iğneler ve Elektroporasyon doldurma ile yardım için yeterince eğitimli bir meslektaşım sor.
DNA aşılama yöntemi aşı antijenleri terzi tasarlamanıza olanak tanır. Bütün antijen klon veya tercihen, hücresel yerelleştirme ve immünojenisite24tarihinde dayalı antijen bölümlerini seçmek mümkündür. Ayrıca, yöntem birkaç antijenleri veya adjuvan bir aşı yapı birleştirerek veya birkaç ayrı plazmid aynı saat2de enjekte sağlar. Kodonu antijen sıra sonra da dahil olmak üzere veya EGFP gen plazmid üzerinden bilincin, ayrıca antijen sonraki N-terminal GFP etiketi olmadan ifade etmek için aynı plazmid vektör yararlanmak mümkündür. Bu GFP nispeten büyük boyutunu antijen katlama etkiler ve bu nedenle potansiyel olarak aşı tarafından uyarılmış humoral yanıt-e doğru sınırlamak gibi pozitif tarama sonuçları teyit makul olabilir.
Daha yüksek bir antijen ifade DNA aşı immünojenisite2‘ ye bağlanmıştır. Elektroporasyon sonra enjeksiyon böylece, dahil edilmiştir Bu protokol için antijenleri veya reporter genler ifade kat artış gösterilmiştir gibi için zebra balığı32on kat. Ayrıca, bir teknik olarak Elektroporasyon orta doku yaralanması, böylece daha fazla aşı indüklenen bağışıklık yanıtı2teşvik yerel iltihap inducing neden olur. Öte yandan, Elektroporasyon genellikle iyi tolere olduğunu. Burada kullanılan ekipman ile hemen hemen yetişkin zebra balığı % 100’ünü de 40 V bu protokolü35kullanılan altı darbeleri kurtarmak.
Elektroporasyon aşı plazmid giriş hücrelere geliştirmek için kullanmaya ek olarak, biz güçlü bir her yerde organizatörü aşı plazmid ve polyA kuyruk 3′ sonunda antijen antijen ifade transfected balık hücrelerdeki artırmanın kullanın. Hedef patojen kodon kullanımını önemli ölçüde aşı türlerden farklıysa, bazı durumlarda, kodon optimizasyonu daha fazla hedef gen ifade2artırmada yararlı bulundu. Bu modelde zebra balığı –M. marinum , ancak, kodon optimizasyonu iki Mikobakteriyel modeli gen, ESAT-6 ve CFP-10, ifade düzeyleri üzerinde önemli bir etkisi vardı ve böylece, bu modelde35 gereksiz kabul .
Hedef gen ifade profilleri arasında örneğin, boyutu ve yapısı antijenleri söz konusu bağlı olarak antijenleri, zamansal bazı varyasyon var. Ancak, antijen ifade genellikle balık ile aynı aşı aşı bir grup içinde benzer. Genellikle, en parlak EGFP ifade dört gün bir hafta postvaccination olarak görülmektedir, ancak 2 – 10 gün ölçeğini mümkündür. Bu büyük ölçekli bir deneyde antijen dahil olmak üzere daha önce ifade balık (2-3) küçük bir grup her antijen-EGFP füzyon proteinin doğrulamak için tavsiye edilir. Hiçbir GFP ifade herhangi bir noktada 2 – 10 gün sonra aşılama görülmektedir, emin olun 1) bağışıklama Protokolü dikkatle izledi. Her zaman pozitif kontrol olarak boş pCMV-EGFP plazmid ile aşı balık bir grup var ve emin olun 2) antijen tasarım ve moleküler klonlama gerçekleştirildiği doğru (yeterli astar tasarım; antijen ve EGFP etiket are her ikisi de aynı okuma çerçevesi ve hiçbir müdahalede bulunan stop kodon dahildir). Bazı durumlarda, doğru antijen tasarım rağmen GFP tespit edilemez. Bu yanlış katlama veya füzyon protein Hızlı arıza nedeniyle olabilir. Bu şartlar altında antijen yeniden tasarlamanız gerekebilir.
Çiftlik balık bağışıklık için kullanılan aşılar içinde kullanılan plazmid dozu genellikle 1 µg veya daha az7,33,34‘ dir. Zebra balığı, muhabir gen ekspresyonu da Elektroporasyon takip en az 0,5 µg plazmid enjeksiyon sonra tespit edilebilir; Ancak, göreceli hedef gen ekspresyonu önemli ölçüde plazmid balık (ek Şekil 1) başına daha yüksek miktarda artırır. PCMV-EGFP muhabir plazmid ile enjekte balıkların, plazmid 5 – 20 µg ile bir enjeksiyon dört sekiz kez balık ile 0,5 µg enjekte ile karşılaştırıldığında daha yüksek EGFP düzeyleri sonuçlandı. Bu nedenle, yeterince yüksek hedef gen ekspresyonu sağlamak, henüz herhangi bir aşırı doku hasarı önlemek için yeterince küçük (≤7 µL) veya aşı sızıntı enjeksiyon birimler var, biz balık başına 5-12 µg ön elemeyi amaçlar için kullanmak üzere seçtiniz. Ek olarak aşı immünojenisite, yeterince hedef gen ekspresyonu muhabir gen ekspresyonu ve western blot, floresan mikroskop ile tespit etmek için gerekli yüksek amaçlar vivo doğru onaylamak için eleme için gerekli olan hedef antijen çeviri. Ancak, plazmid daha düşük dozlarda (0.5-1 µg) deneysel kullanan diğer türleri için yararlı olabilir.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir DNA plazmid ile yetişkin zebra balığı bağışıklama için çeşitli bakteriyel ya da viral enfeksiyonlara karşı yeni aşı aday preklinik testinde kullanılabilir. Aşı antijen ifadesi GFP-füzyon protein olarak başarılı bağışıklama olay ve antijen ifade görselleştirme sağlar. Tüberküloz karşı yeni Aşı antijen adayların preklinik tarama için bu yöntemi uygulamak. Bunun için zebra balığı beş hafta postvaccination bulaştırmak ve bakteriyel qPCR20,24ile her balık sayar belirlemek.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar deneysel İmmünoloji araştırma grubu üyeleri için müteşekkir olan ve özellikle Leena Mäkinen ve yakın Piippo için tüm iş için geliştirilmesi ve aşı Protokolü ve yardımlarına gerçek deneylerde en iyi duruma getirme yaptılar iletişim kuralını kullanarak.
Bu eser Jane ja tarafından desteklenen fotograf Erkon Säätiö (Jane ve fotograf Erkko Vakfı; Mr için), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Vakfı; Mr için), rekabetçi devlet araştırma finansman Tampere Üniversitesi uzman sorumluluk alanının Hastaneye (Mr), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tüberküloz Vakfı; için Mr, H.M. ve M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fin Kültür Vakfı; H.M. için), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (Fin Anti-tüberküloz Vakfı; H.M.) için Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö ve Laina Kivi Vakfı; M.N. için) ve Tampere City Bilim Vakfı (M.N. için).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |