Здесь мы описываем протокол для иммунизации взрослых рыбок данио (Danio рерио) с помощью вакцины на основе ДНК и демонстрации проверки событий успешной вакцинации. Этот метод подходит для доклинических скрининг вакцин-кандидатов в различных моделях инфекции.
За последние два десятилетия возрос интерес к вакцинации на основе ДНК. ДНК вакцинации основан на клонирование последовательности выбранных антиген или сочетание антигенов в плазмиду, который позволяет индивидуальные и безопасный дизайн. Администрация вакцины ДНК в клетки хозяина приводит к экспрессии антигенов, которые стимулируют гуморального и клеточного иммунного ответа. В настоящем докладе описывается протокол для клонирования антигена последовательностей в плазмиду pCMV-EGFP, иммунизации взрослых данио рерио с кандидатами вакцина внутримышечно микроинъекции, и последующего электропорации для улучшения приема. Антигенов вакцины выражаются в виде зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-синтез белков, которые позволяет подтвердить экспрессии антигена под УФ света из живой рыбы и количественная оценка уровня выражения синтез белка с ELISA, а также как их обнаружение с Западный анализ помаркой. Защитный эффект вакцин-кандидатов проверяется путем заражения рыба с Mycobacterium marinum пять недель postvaccination, следуют количественная оценка бактерий с ПЦР через четыре недели. По сравнению с моделями млекопитающих доклинических скрининга, этот метод обеспечивает эффективный метод для предварительного отбора кандидатов Роман на основе ДНК вакцины против микобактериальной инфекции. Метод может применяться для отбора на основе ДНК вакцины против различных бактериальных и вирусных заболеваний.
Первые исследования вакцины ДНК были проведены в 1990-х1, и с тех пор, были протестированы ДНК-вакцин против различных инфекционных заболеваний, рака, аутоиммунные заболевания и специальные2. В млекопитающих ДНК вакцины против вируса Западного Нила в лошадей и терапевтических рака вакцины для собак устные меланома был лицензирован, но они не являются в настоящее время в клинической практике2. В дополнение к интерес вызывали у млекопитающих исследований ДНК вакцинации оказался быть удобным способом для иммунизации рыбные против вирусных заболеваний. Вакцина против вируса инфекционного некроза гемопоэтических рыбы (IHNV) был в коммерческого использования с 2005 года, и вакцина против инфекционной панкреонекроза вируса (IPNV) был недавно лицензированных3. Кроме того в настоящее время разрабатываются несколько ДНК-вакцин против патогенов рыбы.
Как традиционные вакцины часто содержат инактивированных и живых аттенуированных патогенов, они представляют потенциальный риск передачи болезни2. ДНК-вакцин, в свою очередь, предотвратить этот риск, поскольку они основаны на администрации плазмида кодирования бактериальных или вирусных антигенов, вместо того, чтобы весь патогена, сам2,4. ДНК-вакцин производятся с методами рекомбинации ДНК, которые позволяет точный дизайн антигенов вакцины и гибкой формулировке антигена комбинаций и адъювантов в одной вакцины построить5. Кроме того производство вакцины ДНК быстрее, проще и более эффективным, чем рекомбинантных вакцин на основе белков, которые является основным преимуществом для вакцины-кандидата, скрининг целей, но и, например, в случае вспышки пандемии 2.
В рыбе наиболее распространенные маршруты администрации для ДНК-вакцин являются внутрибрюшинного, внутримышечное и устные3,6,7, у млекопитающих, на подкожное и внутрикожные маршруты являются дополнительные параметры2. После внутримышечной инъекции, администрируемых ДНК плазмиды введите клетки на сайте администрирования (например., главным образом миоцитов, но и резидентов антиген представляющих клеток [БТР]). Доля transfected клеток может быть значительно увеличена электропорации2,8. После ввода в ячейку, некоторые плазмиды проникает в ядро, где гены, кодируемых плазмида, транскрибируется2. В этом протоколе мы используем плазмида pCMV-EGFP, который имеет сильную повсеместно промоутер, оптимизированный для eukaryotic выражение9. В этой конструкции антигены переводится как синтез белка с GFP. GFP позволяет подтверждение успешной вакцинации и антиген правильный продукт, простой визуализации экспрессии антигена с флуоресцентным микроскопом в живой рыбы.
В млекопитающих ДНК-вакцин было показано для стимулирования различных типов иммунных реакций в зависимости от transfected клеток типов2,5. Transfected миоцитах выделяют антигены во внеклеточное пространство или освободить их после смерти клетки, и антигены, обхватил БТР впоследствии, на гистосовместимости комплекс II молекул2. Это вызывает реакции клеток CD4 и CD8 T, особенно, в дополнение к клетки B ответы2,5,10. В рыбе лимфоцитов T и B, а также дендритных клеток (DCs), было выявлено, но их разделения труда в презентации антигена является менее хорошо понимали11. Данио рерио DCs, однако, было показано поделиться сохранены фенотипических и функциональные характеристики с их коллегами млекопитающих12. Кроме того было показано ДНК вакцинации добиться аналогичных иммунных реакций в рыб и млекопитающих, в том числе T клетки B ответы6,13,,14и15,16 .
Личинки и взрослые данио рерио широко используются для различных инфекционных заболеваний модели, например модель рыбы marinum м. инфекции туберкулеза, используемые в этот протокол17,18,19,20 ,21,22. По сравнению с млекопитающих модельных организмов преимущества у рыбок данио включают их небольшого размера, быстро воспроизводимости и низким жилищные расходы23. Эти аспекты делают данио рерио идеальная модель животных для крупномасштабных доклинических скрининговых исследований для новых вакцин и фармацевтических соединений23,24,25.
В этом протоколе мы описываем как Роман антигенов вакцины кандидатов против микобактериозов могут быть оценены на основе ДНК вакцинация взрослых рыбок данио. Во-первых мы описываем, как антигены клонируются в плазмиду выражение pCMV-EGFP, следуют подробный протокол для внутримышечного введения вакцины плазмиды и последующего электропорации в мышцы. Выражение каждого антигена подтверждается postimmunization одну неделю микроскопии флуоресцирования. Эффективность антигена кандидатов затем проверен экспериментально заразить привитых рыбы с . м. marinum.
Процедура иммунизации взрослых данио рерио с вакцин на основе ДНК требует некоторых технических знаний. Даже для опытного исследователя вакцинация одной рыбы занимает около 3 минут, за исключением препаратов. Таким образом максимум примерно 100 рыбы могут быть иммунизированы в течение дня. Если более чем 100 рыбы необходимы для эксперимента, прививки можно разделить между до 3 дней. Помимо качества эксперимента достаточную подготовку по researcher(s) для обработки рыбы и проведения иммунизации имеет важное значение для благополучия рыбы. Убедитесь в том следовать местные правовые и животных благосостояния правила и руководящие принципы, когда речь заходит о жилье рыбы, планирования экспериментов и квалификацией, необходимой для персонала, проведение экспериментов.
В целом существует несколько важных шаги, чтобы избежать осложнений в протоколе иммунизации. Для успешного проведения иммунизации, убедитесь, что 1) рыбу, чтобы быть иммунизированы здоровым и достаточно в возраст и размер (иммунизации более молоди может потребовать вниз масштабирования объема вакцины и параметры электропорации); 2) рыба должным образом под наркозом с без сильнее, чем 0,02% 3-аминобензойной кислоты этилового эфира, и они по-прежнему наркотизированных на протяжении всей процедуры (анестезии следует максимально обеспечить восстановление рыбы); 3) Губка pad является правильно пропитанные; 4) Жидкость впрыскивается в каждом импульсе от пневматического насоса и, если нет, длительность импульса корректируется (потянув иглу немного назад вдоль оси y может помочь); 5) Существует нет пузырьков воздуха с решением вакцины; 6) электропорации параметров и фактических импульса напряжения и длина являются правильными; 7) электродов не вызывают повреждение кожи на сайте электропорации (во время электропорация, держать электродов в нежный связаться с рыбой и освободить рыбу непосредственно в резервуар восстановления после электропорации).
Это важно для мониторинга рыб после электропорации в баке восстановления и усыпить любой рыбы, признаки дискомфорта. Кроме того необходимо на практике процедура перед началом крупномасштабного эксперимента, чтобы свободно рабочего процесса. Если возможно попросите помощи с заполнением иглы и электропорации достаточно подготовленных коллега.
Метод вакцинации ДНК позволяет индивидуальный дизайн антигенов вакцины. Это позволяет клонировать весь антиген или, желательно, выбрать части антигена, основанный на клеточной локализации и иммуногенности24. Кроме того метод позволяет объединения нескольких антигены или адъювантов в одной вакцины конструкции или инъекционных несколько отдельных плазмид на же время2. Включая кодоном остановка после последовательности антиген или вырезание EGFP ген от плазмида можно использовать же вектор плазмиды также выразить антигена без последующего N-терминальный GFP-тега. Это может быть разумным в подтверждающих позитивные скрининг результаты, как относительно большой размер GFP может повлиять на складывающиеся антигена и, таким образом, ограничить гуморальные ответы, потенциально вызывали путем вакцинации.
Выражение выше антигена были связаны с иммуногенность вакцины ДНК2. Электропорация после инъекции таким образом, была включена в этот протокол, как это было показано в четыре раза увеличить выражение антигены или репортер генов в zebrafish32в десять раз. Кроме того электропорация как метод вызывает умеренные ткани травмы, таким образом вызывая местного воспаления, что далее способствует вакцины индуцированной иммунные реакции2. С другой стороны электропорация обычно хорошо переносится. С оборудование, используемое здесь практически 100% взрослых рыбок данио будет восстанавливаться хорошо шести импульсов 40 V, используемые в этот протокол35.
Помимо расширения запись плазмида вакцины в клетки с помощью электропорации, мы используем сильные повсеместно промоутер в плазмиду вакцины и хвост поля в конце 3′ антигена для улучшения выражение антигена в клетках transfected рыбы. В некоторых случаях если кодон использование целевых возбудителя значительно отличается от прививки видов, кодон оптимизации был признан полезным для дальнейшего увеличения целевого гена выражение2. В этой моделим. marinum данио рерио – однако, кодон оптимизации не оказало существенного влияния на уровни выражения двух генов микобактериальной модель, ESAT-6 и СЛП-10 и таким образом, было сочтено ненужным в этой модели35 .
Целевой ген выражение профили имеют некоторые временные вариации между антигенами, в зависимости, например, размер и структура антигенов в вопросе. Однако выражение антигена обычно похож внутри группы рыб, иммунизированных вакциной же. Как правило яркое выражение EGFP наблюдается четыре дня до одной недели postvaccination, но возможен в масштабе 2 – 10 дней. Рекомендуется для проверки выражения каждого антиген EGFP синтез белка в небольшой группе рыбы (2 – 3) перед включая антигена в масштабный эксперимент. Если выражение не GFP наблюдается в любой точке 2 – 10 дней после вакцинации, убедитесь, что 1) протокол иммунизации был тщательно следовать. Всегда есть группы рыб, иммунизированных с пустой pCMV-EGFP плазмида как позитивный элемент управления и убедитесь, что 2) антигена дизайн и молекулярное клонирование было осуществлено правильно (адекватные грунтовка дизайн; антиген и EGFP тег находятся в том же рамка чтения и не вмешиваясь кодонов стоп включены). В некоторых случаях, несмотря на правильные антигена дизайн не могут быть обнаружены GFP. Это может быть связано неправильное складывание или Быстрый распад синтез белка. В этих обстоятельствах может потребоваться перестроить антигена.
В вакцины, используемые для иммунизации рыбные плазмида дозировка составляет обычно 1 мкг или менее7,,3334. В данио рерио репортер экспрессии генов может быть также обнаружен после по крайней мере 0,5 мкг плазмида инъекции после электропорации; Однако экспрессии генов относительный целевой значительно увеличивается с большее количество плазмида за рыбы (дополнительный рис. 1). В рыбе, вводится с репортером плазмида pCMV-EGFP инъекции с 5 – 20 мкг плазмида привели к четырех до восьми раз выше EGFP уровней по сравнению с рыбы, вводят 0,5 мкг. Таким образом чтобы обеспечить достаточно высокий целевой экспрессии генов, но иметь инъекции томов, которые являются достаточно мал (≤7 мкл), чтобы не повредить избыточной ткани или утечки вакцины, мы решили использовать 5-12 мкг на рыбы для целей предварительного отбора. В дополнение к иммуногенность вакцины, высокий, требуется достаточно целевое выражение гена для выявления экспрессии гена репортера с флуоресцентным микроскопом и Западная помарка, которая необходима для скрининга целей для подтверждения правильного в естественных условиях перевод целевой антигена. Однако, Нижняя плазмида дозы (0,5 – 1 мкг) может быть полезным для других типов экспериментальных видов использования.
В заключение этот протокол для иммунизации взрослых данио рерио с плазмида ДНК может использоваться в доклинических испытаний новых вакцин-кандидатов против различных бактериальных или вирусных инфекций. Выражение антигена вакцины как белка GFP-фьюжн позволяет визуализировать успешного иммунизации событий и антиген выражения. Мы применяем этот метод для доклинических скрининга кандидатов антигена Роман вакцины против туберкулеза. Для этого мы заразить данио рерио пять недель postvaccination и определить, что бактериальные подсчитывает в каждой рыбы с ПЦР20,24.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны членам исследовательской группы экспериментальной иммунологии, и особенно Leena Мякинен и Hannaleena Piippo, за всю работу они сделали в разработке и оптимизации протокола вакцинации и их помощь в реальных экспериментов использование протокола.
Эта работа была поддержана Джейн ja Aatos Erkon Säätiö (Джейн и Фонд Эркко Aatos; для м.р.), Сигрид Juséliuksen Säätiö (Сигрид Juselius фонд; чтобы м.р.), конкурентные государственное финансирование исследований из области ответственности эксперт Университета Тампере Больница (чтобы м.р.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Тампере туберкулезом фонд; чтобы м.р., его Величество и м.н.), Suomen Kulttuurirahasto (финский культурный фонд; чтобы H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (финский противотуберкулезных Фонд; для его Величества) Вяйно ja Laina Kiven säätiö (Laina Kivi фонд; и Вяйно к м.н.) и Тампере город научным фондом (м.н.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |