DNA ワクチンと大人ゼブラフィッシュ (動脈分布) の予防接種のためのプロトコルについて述べると予防接種の成功イベントの検証方法を説明。このメソッドは、さまざまな感染症モデルにおけるワクチン候補の前臨床スクリーニングに適しています。
DNA に基づく予防接種への関心は、過去 20 年間に増加しています。DNA ワクチンは、一連の選択した抗原または抗原の組み合わせをオーダーメイドで安全な設計を可能にするプラスミドにクローニングに基づいています。宿主細胞に DNA ワクチンの投与は、体液性および細胞性免疫応答を刺激する抗原の発現に します。このレポートでは、抗原のシーケンス pCMV EGFP プラスミド、摂取量を改善するために筋肉内マイクロインジェクションと後続のエレクトロポレーションによるワクチン候補者と成人のゼブラフィッシュの予防接種のクローニングのためのプロトコルについて説明します。ワクチン抗原、緑色蛍光タンパク質 (GFP) として表されます-融合蛋白質として生きた魚と同様、elisa 法による融合タンパク質の発現レベルの定量化から紫外線の下で抗原の発現の確認を可能にします。西部のしみの分析と検知します。ワクチン候補の保護効果は結核菌 marinum 5 週間 postvaccination で魚を感染させることによってテストが続いて qPCR で細菌の数量化による 4 週間後。哺乳類の前臨床スクリーニング モデルに比べると、このメソッドは、抗酸菌感染症に対する新規 DNA ワクチン候補者の選考のためコスト効果の高い方法を提供します。メソッドは、さまざまな細菌やウイルスの病気に対する DNA 基づかせていたワクチンをスクリーニングにさらに適用できます。
1990 年代に1で最初の DNA ワクチン研究を行った、それ以来、DNA ワクチンは、様々 な感染症、癌、自己免疫疾患、およびアレルギー2に対してテストされています。哺乳動物で、馬のウエスト ナイル ウイルスに対する DNA ワクチンとイヌ口腔悪性黒色腫のがん治療用ワクチンがライセンスされているが、これらは現在臨床使用2。哺乳類研究により誘発される利息に加えて DNA ワクチンがウイルス性疾患と養殖魚の免疫する便利な方法であると判明します。2005 年以来、商業利用されている魚伝染性造血器壊死症ウイルス (IHNV) に対するワクチンと伝染性膵臓壊死症ウイルス (IPNV) に対するワクチンは最近認可された3。さらに、魚の病原体に対するいくつかの DNA ワクチンが開発されています。
従来のワクチンはしばしば、不活化またはライブ弱毒病原体を含む、彼らは病気2を送信する潜在的な危険性をもたらします。彼らは全体の病原体自体ではなく、細菌やウイルスの抗原を2,4エンコード プラスミドの管理に基づいているため DNA ワクチン、ターンでは、このリスクを回避します。DNA ワクチンは、単一ワクチン構成5ワクチン抗原の精密な設計および抗原の組み合わせやアジュバントの柔軟な定式化を可能にする DNA 組換え技術で生産されています。さらに、DNA ワクチンの生産はより速くより簡単に、タンパク質ベース組換えワクチン、ワクチン候補スクリーニング目的のため、また、パンデミック発生の場合の例の主要な利点はよりコスト効率2。
魚、DNA ワクチンの最も一般的な投与経路、筋肉内投与、腹腔内および経口3,6、7中、に哺乳類の皮下、皮内ルート追加オプション2。筋肉内注射をした後投与の DNA プラスミド入力管理サイトにあるセル (e.g。、主細胞、しかしも居住者抗原提示細胞 [Apc])。エレクトロポレーション2,8transfected セルの割合を大幅に改善できます。セルを入力した後、いくつかのプラスミド DNA はプラスミッドによって符号化される遺伝子が転写2核に入る。このプロトコルでは、真核生物式9用に最適化された強力なユビキタス プロモーターを持つ pCMV EGFP プラスミドを利用します。このコンス トラクターには、抗原は、GFP との融合タンパク質として変換されます。GFP 活魚の蛍光顕微鏡による抗原の発現の単純な可視化による成功したワクチン接種と正しい抗原製品の確認をできます。
哺乳類の DNA ワクチンを transfected セル型2,5によって免疫応答の種類を刺激するために示されています。トランスフェクション細胞抗原を細胞外に分泌や Apc によって包まれている抗原が主要組織適合遺伝子複合体 II 分子2に表示されて、その後、細胞死にそれらを解放します。これは B 細胞の応答2,5,10に加えて特に、CD4 および CD8 T 細胞の応答をトリガーします。魚、T および B リンパ球と樹状細胞 (Dc)、識別されている、まだ抗原提示の分業はあまりよく理解されて11。ただし、ゼブラフィッシュ Dc は、哺乳類の対応12の省の表現型および機能特性を共有する示されています。さらに、DNA ワクチンは、T および B 細胞の応答6,13,14,15,16 を含む哺乳類、魚と同様の免疫反応を引き出すために示されています。.
両方の幼虫と大人のゼブラフィッシュ モデル別の感染症結核このプロトコル17,18,19,20 で使用の魚・ m ・ marinum感染症モデルなどに幅広く使われて ,21,22。哺乳類のモデル生物と比較してゼブラフィッシュのメリットは、サイズが小さく、高速な再現性と低いハウジング費用23。これらの側面は、ゼブラフィッシュに新規ワクチンや医薬品化合物23,24,25の大規模な前臨床スクリーニング研究のための理想的な動物モデルを作る。
このプロトコルではアダルト ゼブラフィッシュ DNA に基づくワクチン接種による抗酸菌症に対して候補者を評価できる方法新規ワクチン抗原をについて説明します。まず、我々 は筋にワクチン プラスミドと後続のエレクトロポレーションの筋肉内注射のための詳しいプロトコルが続いて pCMV EGFP 発現プラスミドに抗原を複製する方法について説明します。各抗原の発現は、蛍光顕微鏡 1 週間 postimmunization によって確認されます。M. marinum魚のワクチン接種を実験的に感染させることによって、抗原候補の有効性がテストされます。
大人のゼブラフィッシュ DNA 基づかせていたワクチンとの免疫の手順には、いくつかの技術的な専門知識が必要です。経験豊富な研究員の準備を除く約 3 分を取る 1 つの魚を接種します。したがって、約 100 の魚の最大の免疫は、日以内に。100 以上の魚は、実験のために必要がある場合は、3 日前までの間予防接種を分けることができます。実験の品質に加えて、もっとも魚を処理し、予防接種を実行するための十分な訓練は魚の幸福にとって不可欠です。ときは住宅計画、実験と実験を行う者に必要な資格、魚、地元の法律や動物福祉規則とガイドラインに従うことを確認してください。
要約すると、予防接種プロトコルでは合併症を避けるためにいくつかの重要な手順があります。成功した予防接種することを確認1)免疫になる魚が健康で十分な年齢とサイズ (より稚魚の予防接種にダウン スケール ワクチン ボリュームとエレクトロポレーション設定が必要することができます)。2)魚が正しくない麻酔 0.02 %3-アミノ安息香酸エチルより強い彼らのプロシージャ全体で麻酔をかけられたまま (麻酔を保持する魚の回復を確実に可能な限り短い)3)スポンジ パッドが正しくずぶぬれ;4)空気圧ポンプから各パルスで液体を注入し、パルスの長さが調整されていない場合 (y 軸に沿って少し後方針を引っ張って助けることができる);5)ワクチン ソリューションと気泡がないです。6)エレクトロポレーションの設定と実際のパルス電圧および長さが正しい;7)電極損害を与えるない皮膚エレクトロポレーション敷地 (エレクトロポレーション、維持電極が穏やかで、魚との接触、エレクトロポレーション後すぐに回収タンクに魚をリリース)。
汚水回収タンクでエレクトロポレーション後魚を監視し、不快感の兆しを見せて魚を安楽死させるのには重要です。さらに、流暢なワークフローを確保するための大規模な実験を開始する前の手順を練習する必要は。可能であれば、針や、エレクトロポレーションを充填の援助を十分に訓練を受けた同僚を求めます。
DNA のワクチン接種方法には、ワクチン抗原のオーダーメイド設計ができます。全体の抗原のクローンを作成または、好ましくは、細胞の局在と免疫原性24に基づいて抗原の部分を選択することが可能です。さらに、メソッドは、1 つワクチン構成にいくつかの抗原やアジュバントを組み合わせてまたは同じ time2にいくつかの独立したプラスミドを注入できます。抗原シーケンスの後停止コドンを含むかプラスミッドから EGFP 遺伝子を切除によって、後続の N 末端 GFP タグなし抗原を表現するためにも同じプラスミッドのベクトルを利用することが可能です。これは、GFP のサイズが比較的大きいことができる抗原の折りたたみ影響を与えるし、したがって、可能性のある予防接種により誘発される体液性応答を制限する肯定的な審査結果を確認することに合理的な可能性があります。
高い抗原の発現は、DNA ワクチンの免疫原性2にリンクされています。4 倍抗原またはからレポーター遺伝子の発現を増強する示されているように、注射後エレクトロポレーションこのプロトコルに含まれているはしたがって、ゼブラフィッシュ32で 10 倍に。さらに、エレクトロポレーション技術としてこうしてワクチンによる免疫応答2をさらに促進する局所の炎症を誘導、適度な組織の損傷が発生します。その一方で、エレクトロポレーションは一般的によく容認です。ここで使用される機器、実質的に大人のゼブラフィッシュの 100% は 40 でこのプロトコル35V の 6 パルスからよく回復します。
エレクトロポレーションを使用すると、セルにワクチン プラスミドのエントリを強化、に加えて、ワクチン プラスミッドおよびポリア尻尾での強力なユビキタス プロモーターの使用抗原の 3′ 終わりに transfected 魚類細胞の抗原の表現を向上させる。いくつかのケースで大幅ワクチン接種種と異なる場合は対象病原体のコドン コドン最適化見つかってターゲット遺伝子の表現の2のさらなる向上に役に立つ。このゼブラフィッシュ –M. marinumモデルで、コドン最適化イースト 6とCFP-10、 2 つの抗酸菌モデル遺伝子の発現レベルに重大な影響がなかったし、したがってと判断されているこのモデル35 で不要です.
ターゲット遺伝子発現プロファイルによっては、インスタンスのサイズと問題の抗原の構造上、抗原の間いくつかの変化があります。しかし、抗原の発現は、同じワクチンで免疫した魚のグループ内で通常似ています。通常、最も明るい EGFP 発現観察 4 日 1 週間 postvaccination に、2-10 日のスケールが可能です。大規模な実験では、抗原を含む前に魚 (2-3) の小さいグループである各抗原 EGFP の融合蛋白質の表現を検証することをお勧めします。GFP 発現が観測されない任意の時点で予防接種後 2-10 日場合、ことを確認1)免疫プロトコルは慎重に続いた。常に肯定的な制御として空 pCMV EGFP プラスミドで免疫した魚のグループがあるし、ことを確認2)抗原デザインおよび分子クローニングは正しく遂行された (適切なプライマー デザイン; 抗原と EGFP タグ両方が同じリーディング ・ フレームとない介在停止コドンとなる含まれます)。正しい抗原デザインにもかかわらず、いくつかのケースでは、GFP が検出できません。これは誤った折りたたみまたは融合蛋白質の急速な破壊が原因かもしれません。このような状況では、抗原を再設計する必要があります。
養殖魚を予防接種に使用されるワクチンに使用されるプラスミド用量は通常 1 μ g またはより少ない7,33,34。レポーター遺伝子の発現は、ゼブラフィッシュ、次のエレクトロポレーション; 少なくとも 0.5 μ g のプラスミド注射後も検出できます。ただし、相対的なターゲット遺伝子発現は魚 (補足図 1) あたりプラスミドの高い量が大幅増加します。魚 pCMV EGFP 記者プラスミドを注入で 0.5 μ g を注入した魚と比較してレベルの高い EGFP 8 回に 4 つのプラスミドの 5-20 μ g を注入しました。したがって、十分に高くターゲット遺伝子発現を確認ながらワクチン漏れは十分に小さい (≤7 μ L) 過剰な組織損傷を防ぐため、注入量を持つこと、我々 は予備審査用魚あたり 5 に 12 μ g を使用しました。ワクチンの免疫原性、蛍光顕微鏡と西部のしみ、レポーター遺伝子の発現を検出する十分なターゲット遺伝子発現が必要高に加えてスクリーニング目的のため生体内で正しいことを確認する必要があります。標的抗原の翻訳。ただし、線量の低いプラスミド (0.5 – 1 μ g)、実験用途の他のタイプに便利です。
結論としては、さまざまな細菌やウイルス感染症に対する新しいワクチン接種の候補者の前臨床試験で DNA のプラスミッドと大人のゼブラフィッシュの予防接種のためこのプロトコルを使用できます。GFP 融合タンパク質としてワクチン抗原の発現は、予防接種の成功イベントと抗原発現の可視化できます。この結核に対する新規ワクチンの抗原候補の前臨床スクリーニング法を適用します。このため、私たちはゼブラフィッシュ 5 週間 postvaccination に感染し、細菌カウント qPCR20,24それぞれの魚を決定します。
The authors have nothing to disclose.
著者は、レーナ ・ Mäkinen と Hannaleena ・ ピッポ、特にすべての仕事のために行っている開発とワクチン接種のプロトコル、および実際の実験で彼らの助けの最適化、実験免疫学研究グループのメンバーに感謝しています。プロトコルを使用しています。
この作品は、ジェーンの ja によって支えられた Aatos Erkon Säätiö (ジェーンと Aatos Erkko 財団原産地に)、ねんどろいど Juséliuksen Säätiö (ねんどろいど Juselius 財団原産地する)、タンペレ大学の専門家の責任領域の競争状態の研究資金(修士課程) に病院、演奏 Tuberkuloosisäätiö (タンペレ結核財団; 原産地に陛下と m. n.)、Suomen Kulttuurirahasto (フィンランド文化財団; 陛下に)、Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (フィンランドの結核財団;陛下) に Väinö ja Laina テクスチャペインティング säätiö (Väinö と Laina キビ財団 m. n. に) および (m. n.) にタンペレ市科学財団。
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |