Nous décrivons ici un protocole pour la vaccination de l’adulte poisson zèbre (Danio rerio) avec un vaccin à base d’ADN et de démontrer la validation d’un événement de vaccination réussie. Cette méthode convient pour la projection préclinique de vaccins candidats dans divers modèles d’infection.
L’intérêt pour la vaccination de base d’ADN a augmenté au cours des deux dernières décennies. La vaccination ADN est basée sur le clonage d’une séquence d’un antigène sélectionné ou une combinaison d’antigènes dans un plasmide, qui permet une conception sur mesure et en toute sécuritaire. L’administration de vaccins à ADN dans les cellules hôtes conduit à l’expression des antigènes qui stimulent la réponse immunitaire humorale et à médiation cellulaire. Ce rapport décrit un protocole de clonage des séquences d’antigène dans le plasmide CMVp-EGFP, la vaccination des adulte poisson zèbre avec les vaccins potentiels par microinjection intramusculaire et l’électroporation ultérieure afin d’améliorer l’apport. Les antigènes sont exprimés sous forme de la protéine fluorescente verte (GFP)-protéines de fusion, qui permet la confirmation de l’expression de l’antigène sous ultraviolets de poissons vivants et la quantification des niveaux d’expression de la protéine de fusion avec ELISA, ainsi que leur détection avec une analyse par western blot. L’effet protecteur des candidats vaccins est testé en infectant les poissons avec après la vaccination Mycobacterium marinum cinq semaines, suivie de la quantification de la bactérie avec le qPCR quatre semaines plus tard. Par rapport aux modèles de dépistage préclinique chez les mammifères, cette méthode fournit une méthode rentable pour la présélection des candidats nouveaux vaccins basés sur l’ADN contre une infection mycobactérienne. La méthode peut être appliquée plus de dépistage basées sur l’ADN vaccins contre diverses maladies bactériennes et virales.
Les premières études de vaccin ADN ont été effectuées dans les années 19901, et depuis lors, les vaccins à ADN ont été testés contre diverses maladies infectieuses, le cancer, l’auto-immunité et allergie2. Chez les mammifères, un vaccin à ADN contre le virus du Nil occidental chez les chevaux et un vaccin contre le cancer thérapeutique contre le mélanome orale canin ont été licenciés, mais ce ne sont pas actuellement en usage clinique2. Outre l’intérêt évoquée par des études chez les mammifères, la vaccination ADN a avéré pour être un moyen pratique d’immuniser contre les maladies virales, les poissons d’élevage. Un vaccin contre le virus de poissons la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) a été en usage commercial depuis 2005, et un vaccin contre le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (VNPI) a été récemment autorisé3. En outre, plusieurs vaccins à ADN contre les pathogènes de poissons sont développées.
Comme les vaccins traditionnels contiennent souvent inactivés ou vivants pathogènes atténués, ils posent un risque potentiel de transmission de la maladie2. Vaccins à ADN, à son tour, d’éviter ce risque, puisqu’elles sont basées sur l’administration de plasmide codant des antigènes bactériens ou virus, plutôt que de tout pathogène lui-même2,4. Vaccins à ADN sont produites avec les techniques de recombinaison d’ADN, qui permet la conception précise des antigènes vaccinaux et la formulation souple de combinaisons antigène et adjuvants dans un seul vaccin construct5. En outre, la production de vaccins à ADN est plus rapide, plus facile et plus rentable que celle des vaccins recombinants basées sur les protéines, ce qui est un atout majeur pour le candidat vaccin fins de sélection, mais aussi, par exemple, en cas de pandémie flambées 2.
Chez les poissons, les voies d’administration plus courantes pour les vaccins à ADN sont intrapéritonéale, intramusculaire et orale3,6,7, tandis que chez les mammifères, sous-cutanée et intradermiques itinéraires sont des options supplémentaires2. Après une injection intramusculaire, les plasmides d’ADN administrés entrer dans les cellules au site d’administration (p. ex.., principalement les myocytes, mais aussi les résidents cellules présentatrices d’antigène [CPA]). La proportion de cellules transfectées peut être considérablement augmentée par électroporation2,8. Après être entré dans la cellule, certains l’ADN de plasmide pénètre dans le noyau, où les gènes codés par le plasmide sont transcrit2. Dans ce protocole, nous utilisons le plasmide CMVp-EGFP disposant d’un puissant promoteur omniprésent optimisé pour expression eucaryote9. Dans cette construction, les antigènes sont traduits comme une protéine de fusion avec un GFP. La GFP permet la confirmation d’une vaccination réussie et le produit correct de l’antigène par la simple visualisation d’expression de l’antigène avec un microscope à fluorescence de poissons vivants.
Chez les mammifères, les vaccins à ADN ont démontré pour stimuler les différents types de réponses immunitaires selon le types de cellules transfectées2,5. Les myocytes transfectées sécrètent des antigènes dans l’espace extracellulaire ou libérez-les sur la mort cellulaire, et les antigènes engloutis par les APC sont, par la suite, présentés sur les molécules d’II du complexe majeur d’histocompatibilité2. Cela déclenche des lymphocytes CD4 et CD8 T, en particulier, en plus de lymphocytes B réponses2,5,10. Chez les poissons, les lymphocytes T et B, ainsi que les cellules dendritiques (CD), ont été identifiés, mais leur division du travail dans la présentation des antigènes est moins bien compris11. DCs de poisson-zèbre, toutefois, ont démontré que partagent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles conservés avec leurs homologues mammifères12. En outre, vaccination ADN a été montrée pour induire des réponses immunitaires similaires chez les poissons et chez les mammifères, y compris les T et les lymphocytes B réponses6,13,14,15,16 .
Les larves et les adulte poisson zèbre sont largement utilisés pour différentes maladies infectieuses modèle, tel que le modèle d’infection M. marinum poisson de la tuberculose utilisé dans ce protocole17,18,19,20 ,21,22. En comparaison avec des organismes modèles chez les mammifères, les avantages du poisson-zèbre comprennent leur petite taille, la reproductibilité rapide et faible logement frais23. Ces aspects font le poisson-zèbre, un modèle animal idéal pour des études précliniques à grande échelle de vaccins innovants et des composés pharmaceutiques23,24,25.
Dans ce protocole, nous décrivons comment roman antigène vaccinal candidats contre Mycobactériose peuvent être évaluées par la vaccination basées sur l’ADN des poissons zèbres adultes. Tout d’abord, nous décrivons comment les antigènes sont clonés dans le plasmide d’expression CMVp-EGFP, suivi d’un protocole détaillé pour l’injection intramusculaire de plasmides de vaccin et l’électroporation ultérieure dans le muscle. L’expression de chaque antigène est confirmée par les sérologies d’une semaine la microscopie par fluorescence. L’efficacité des candidats antigène est ensuite testée par infecter expérimentalement des poissons vaccinés avec M. marinum.
La procédure de vaccination des adulte poisson zèbre avec vaccins ADN nécessite une expertise technique. Même pour un chercheur expérimenté, vacciner un seul poisson prend environ 3 min, à l’exclusion des préparations. Ainsi, un maximum de poissons environ 100 peut être immunisé en une journée. Si plus de 100 poissons sont nécessaires pour l’expérience, les vaccinations peuvent être divisées entre jusqu’à 3 jours. Outre la qualité de l’expérience, une formation suffisante des chercheurs pour manipulation du poisson et l’exécution de la vaccination est essentielle pour le bien-être des poissons. Assurez vous de suivre les lignes directrices et règles locales légales et de bien-être animal en ce qui concerne les poissons, les expériences et les qualités requises pour le personnel effectuant les expériences de planification du logement.
En résumé, il y a plusieurs étapes cruciales pour éviter des complications dans le protocole de vaccination. Pour la vaccination réussie, vérifiez que 1) le poisson soient vaccinés est sains et suffisamment en âge et en taille (la vaccination de plus juvéniles peut exigez échelle vers le bas le volume de vaccin et les paramètres d’électroporation) ; 2) les poissons sont correctement anesthésiés avec non plus fort que 0,02 % 3-aminobenzoïque acide éthyl ester, et ils restent anesthésiés pendant toute la procédure (anesthésie doit être conservé aussi courte que possible pour assurer la récupération du poisson) ; 3) le plateau en mousse est bien trempé ; 4) liquide est injecté dans chaque impulsion de la pompe pneumatique et, sinon, la durée d’impulsion est ajustée (tirant l’aiguille légèrement en arrière le long de l’axe y peut aider) ; 5) il n’y a pas de bulles d’air avec la solution de vaccin ; 6) les paramètres de l’électroporation et la tension d’impulsion réelle et la longueur sont corrects ; 7) les électrodes ne causent pas de dommages à la peau sur le site d’électroporation (au cours de l’électroporation, gardez les électrodes dans douce en contact avec le poisson et libérer le poisson immédiatement dans le réservoir de récupération après électroporation).
Il est important de surveiller le poisson après l’électroporation dans le réservoir de récupération et d’euthanasier les poissons montrent des signes d’inconfort. En outre, il est nécessaire de pratiquer la procédure avant de commencer une expérience à grande échelle, afin d’assurer un flux de travail courant. Si possible, demandez à un collègue suffisamment formé pour l’assistance avec les aiguilles et l’électroporation de remplissage.
La méthode de vaccination ADN permet de concevoir sur mesure des antigènes vaccinaux. Il est possible de cloner l’antigène entier ou, préférablement, sélectionner des parties de l’antigène basés sur la localisation et l’immunogénicité cellulaire24. En outre, la méthode permet combiner plusieurs antigènes ou adjuvants en construction un vaccin ou injecter plusieurs plasmides distincts dans le même temps2. En incluant un codon d’arrêt après la séquence de l’antigène ou en retranchant les gènes EGFP du plasmide, il est possible d’utiliser le même vecteur plasmidique aussi pour exprimer l’antigène sans l’étiquette de N-terminal GFP ultérieur. Cela peut être raisonnable pour confirmer les résultats de dépistage positifs, comme la taille relativement grande de GFP peut affecter le pliage de l’antigène et, ainsi, de limiter les réponses humorales potentiellement induites par la vaccination.
Une expression de l’antigène plus élevée a été liée à l’ADN d’immunogénicité du vaccin2. Électroporation après injection ainsi, a été incluse dans le présent protocole, comme il a été montré pour augmenter l’expression des antigènes ou des gènes rapporteurs de quatre à dix fois dans le poisson-zèbre,32. Par ailleurs, électroporation comme technique provoque des lésions modérées, induisant ainsi une inflammation locale qui favorise davantage le vaccin a induit des réponses immunitaires2. En revanche, l’électroporation est généralement bien tolérée. Avec le matériel utilisé ici, pratiquement 100 % du poisson-zèbre adulte va récupérer bien partir les six impulsions de 40 V utilisée dans ce protocole35.
Outre l’utilisation d’électroporation pour améliorer l’entrée du plasmide vaccin dans les cellules, nous utilisons un ardent promoteur omniprésent dans le plasmide de vaccin et une queue polyA à l’extrémité 3′ de l’antigène pour améliorer l’expression de l’antigène dans les cellules transfectées de poissons. Dans certains cas, si l’utilisation de codon de l’agent pathogène cible diffère considérablement de l’espèce vaccinés, optimisation de codons a été trouvée utile pour renforcer encore la cible gene expression2. Dans ce modèle de poisson-zèbre –M. marinum , cependant, optimisation de codons n’eu aucun effet significatif sur les niveaux d’expression de deux gènes modèle mycobactériennes, ESAT-6 et CFP-10 et a, ainsi, été considérées comme nécessaire dans ce modèle35 .
Profils d’expression des gènes cible ont des variations temporelles entre les antigènes, selon, par exemple, la taille et la structure des antigènes en cause. Cependant, l’expression de l’antigène est généralement similaire au sein d’un groupe de poissons vaccinés avec le vaccin même. En règle générale, la plus brillante expression EGFP est observée quatre jours, une semaine après la vaccination, mais une échelle de 2 à 10 jours est possible. Il est recommandé de valider l’expression de chaque protéine de fusion d’antigène-EGFP dans un petit groupe de poissons (2 – 3) avant d’inclure l’antigène dans une expérience à grande échelle. Si aucune expression de la GFP n’est observée à n’importe quel point 2 – 10 jours après la vaccination, assurez-vous que 1) le protocole de vaccination a été bien suivi. Toujours avoir un groupe de poissons vaccinés avec le plasmide vide CMVp-EGFP comme témoin positif et s’assurer que 2) la conception de l’antigène et le clonage moléculaire a été effectué correctement (conception d’amorce adéquate ; l’antigène et la balise EGFP sont à la fois dans la même trame de lecture et aucune intervention codons stop sont inclus). Dans certains cas, malgré la conception correcte de l’antigène, GFP ne peuvent pas être détecté. Cela peut être causée par un mauvais pliage ou la rapide dégradation de la protéine de fusion. Dans ces circonstances, il peut être nécessaire de revoir l’antigène.
Dans les vaccins permettant d’immuniser des poissons d’élevage, la dose de plasmide utilisée est généralement de 1 µg ou moins7,33,34. Chez le poisson zèbre, expression du gène rapporteur peut également être détectée après au moins une injection de plasmide 0,5 µg après électroporation ; Toutefois, l’expression du gène cible relative augmente de manière significative avec un montant plus élevé du plasmide par poisson (supplémentaire Figure 1). Chez les poissons injectés avec le plasmide de journaliste CMVp-EGFP, une injection de 5 à 20 µg de plasmide a entraîné quatre à huit fois supérieur EGFP niveaux par rapport aux poissons injecté avec 0,5 µg. Par conséquent, pour assurer une expression du gène cible suffisamment élevée, tout en ayant des volumes d’injection qui sont assez petit (≤7 µL) pour empêcher tout endommagement des tissus en excès ou fuite de vaccin, nous avons choisi utiliser 5 à 12 µg / poisson à des fins de présélection. En plus de l’immunogénicité des vaccins, un haut assez l’expression des gènes cible est nécessaire pour détecter l’expression du gène rapporteur avec un microscope à fluorescence et tache occidentale, qui est nécessaire pour les fins de confirmer la bonne in vivo de la présélection traduction de l’antigène cible. Cependant, le plasmide plus faible doses (0,5 à 1 µg) peut être utile pour d’autres types d’utilisations expérimentales.
En conclusion, le présent protocole pour la vaccination des adulte poisson zèbre avec un plasmide d’ADN peut être utilisé dans les essais précliniques de nouveaux vaccins candidats contre diverses infections bactériennes ou virales. L’expression de l’antigène vaccinal comme une protéine GFP-fusion permet la visualisation d’une expression d’événement et l’antigène de vaccination réussie. Nous appliquons cette méthode de dépistage préclinique des candidats de l’antigène du nouveau vaccin contre la tuberculose. Pour ce faire, nous infecter l’après la vaccination cinq semaines poisson-zèbre et déterminer que les bactéries compte dans chaque poisson avec qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs sont reconnaissants aux membres du groupe de recherche immunologie expérimentales, et surtout à Leena Mäkinen et Hannaleena Piippo, pour tout le travail qu’ils ont accompli dans l’élaboration et l’optimisation du protocole de vaccination et leur aide dans des expériences réelles en utilisant le protocole.
Ce travail a été soutenu par Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Jane et Aatos Erkko Foundation ; à M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Fondation Juselius Sigrid ; pour M.R.), la concurrence recherche financement par l’état de la zone de responsabilité de l’Expert de l’Université de Tampere L’hôpital (M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberculose Foundation ; pour M.R., H.M. et M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fondation culturelle finlandaise ; pour H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finlandaise contre la tuberculose Fondation ; à H.M.), Väinö ja säätiö de Laina Kiven (Väinö et Laina Kivi Foundation ; à M.N.) et la ville de Tampere Science Foundation (à M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |