Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Impfung von der Erwachsenen Zebrabärbling (Danio Rerio) mit einem DNA-basierten Impfstoff und die Validierung einer erfolgreichen Impfung Veranstaltung zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für die präklinische Screening Impfstoffkandidaten in verschiedenen Infektionsmodelle.
Das Interesse an DNA-basierte Impfung hat in den vergangenen zwei Jahrzehnten zugenommen. DNA-Impfung basiert auf das Klonen einer Sequenz von einem ausgewählten Antigen oder eine Kombination von Antigenen in ein Plasmid, das eine maßgeschneiderte und sichere Konstruktion ermöglicht. Die Verabreichung von Impfstoffen DNA in Wirtszellen führt auf den Ausdruck von Antigenen, die humoralen und zellvermittelten Immunantwort stimulieren. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zum Klonen von Antigen-Sequenzen in der pCMV-EGFP-Plasmid, die Impfung von Erwachsenen Zebrafisch mit den Impfstoffkandidaten durch intramuskuläre Mikroinjektion und die anschließende Elektroporation zur Aufnahme zu verbessern. Die Impfstoff-Antigene werden als grün fluoreszierendes Protein (GFP) ausgedrückt-Fusionsproteine, wodurch die Bestätigung des Ausdrucks unter UV-Licht von lebenden Fischen und die Quantifizierung der Ausdruck Niveaus des Fusionsproteins mit ELISA, sowie als Antigen Ihre Erkennung mit einem western-Blot-Analyse. Die schützende Wirkung der Impfstoffkandidaten wird getestet durch infizieren den Fisch mit Mycobacterium Marinum fünf Wochen Postvaccination, gefolgt von der Quantifizierung der Bakterien mit qPCR vier Wochen später. Im Vergleich zu Säugetieren präklinischen Screening-Modelle, bietet diese Methode eine kosteneffektive Methode für die Vorauswahl der neuartigen DNA-basierte Impfstoffkandidaten gegen eine mykobakteriellen Infektion. Die Methode kann weitere screening-DNA-basierte Impfstoffe gegen verschiedene bakterielle und virale Krankheiten.
Die erste DNA-Impfstoff-Studien wurden in den 1990er Jahren1durchgeführt, und seitdem wurden DNA-Impfstoffe gegen verschiedene Infektionskrankheiten, Krebs, Autoimmunität und Allergie2getestet. Bei Säugetieren eine DNA-Impfstoff gegen West-Nil-Virus bei Pferden und einer therapeutischen Krebs-Impfstoff für Hunde oral Melanom zugelassen, aber diese sind derzeit nicht im klinischen Einsatz2. Neben dem Interesse hervorgerufen durch Säugetier-Studien hat DNA-Impfung erwies sich eine komfortable Möglichkeit, Zuchtfisch gegen Viruserkrankungen zu immunisieren. Ein Impfstoff gegen Fisch infektiösen hämatopoetischen Nekrose Virus (IHNV) ist bereits im kommerziellen Einsatz seit 2005, und ein Impfstoff gegen das Virus der infektiösen pankreatischen Nekrosen (IPNV) wurde vor kurzem lizenzierten3. Darüber hinaus werden mehrere DNA-Impfstoffen gegen Fisch Krankheitserreger entwickelt.
Als herkömmliche Impfstoffe oft inaktivierte oder live abgeschwächte Erregern enthalten, stellen sie ein potenzielles Risiko einer Übertragung der Krankheit2. DNA-Impfstoffe abzuwenden wiederum dieses Risiko, da sie auf die Verwaltung des Plasmids Codierung bakterielle oder virale Antigene, anstatt den ganzen Erreger selbst2,4. DNA-Impfstoffe werden mit DNA-Rekombination Techniken, wodurch die genaue Ausgestaltung der Impfstoff Antigene und die flexible Formulierung von Antigen-Kombinationen und Hilfsstoffe in einem einzigen Impfstoff Konstrukt5hergestellt. Darüber hinaus ist die Produktion von DNA-Impfstoffen schneller, einfacher und kostengünstiger als die von Protein-basierten rekombinanten Impfstoffen, das ist ein großer Vorteil für Impfstoffkandidat screening-Zwecken, sondern auch, um beispielsweise bei Pandemie Ausbruch 2.
Bei Fischen die am weitesten verbreiteten Verwaltung Routen für DNA-Impfstoffe sind intraperitoneal, intramuskuläre und mündliche3,6,7, während bei Säugetieren, subkutane und intrakutane Routen sind Zusatzoptionen2. Nach einer intramuskulären Injektion Aldenhoff DNA Plasmide geben Sie die Zellen am Standort Verwaltung (zB., meist Myozyten, sondern auch Wohnsitz Antigen-präsentierenden Zellen [APCs]). Der Anteil von transfizierten Zellen kann durch Elektroporation2,8deutlich erhöht werden. Nach der Eingabe der Zelle, tritt einige Plasmid DNA den Zellkern, wo sind die durch das Plasmid kodiert Gene transkribiert2. In diesem Protokoll nutzen wir die pCMV-EGFP-Plasmid, das einen starken allgegenwärtigen Promotor für eukaryotische Ausdruck9optimiert hat. In diesem Konstrukt werden die Antigene als ein Fusionsprotein mit einem GFP übersetzt. Die GFP ermöglicht die Bestätigung der erfolgreichen Impfung und das richtige Antigen Produkt von der einfachen Visualisierung des Antigen-Ausdruck mit einem Fluoreszenzmikroskop in lebendem Fisch.
Bei Säugetieren wurden DNA-Impfstoffe gezeigt, verschiedene Arten von Immunreaktionen abhängig von transfizierten Zellen Typen2,5zu stimulieren. Transfizierte Myozyten absondern Antigene in den Extrazellulärraum oder lassen Sie sie bei der Zelltod und die Antigene von APCs verschlungen werden, anschließend auf großen Histocompatibility complex II Moleküle2vorgestellt. Dies löst CD4 und CD8 T-Zell-Reaktionen, vor allem, neben der B-Zell-Antworten2,5,10. In Fisch T- und B-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs), wurden noch ihre Arbeitsteilung in Antigenpräsentation weniger gut verstanden11 ist. Zebrafisch DCs haben jedoch gezeigt, konservierte phänotypische und funktionelle Merkmale mit ihrer Säugetier-Pendants12teilen. Darüber hinaus hat DNA-Impfung nachweislich ähnliche Immunantworten in Fischen und Säugetieren, einschließlich des T- und B-Zellen Antworten6,13,14,15,16 entlocken .
Larven und Erwachsene Zebrafisch sind verbreitet, Modell verschiedene Infektionskrankheiten, wie der Fisch M. Marinum Infektionsmodell an Tuberkulose, die in diesem Protokoll17,18,19,20 verwendet ,21,22. Im Vergleich zu Säugetieren Modellorganismen die Vorteile der Zebrafisch sind ihre geringe Größe, schnelle Reproduzierbarkeit und niedrige Kosten23Gehäuse. Diese Aspekte machen den Zebrafisch ideale Tiermodell für umfangreiche präklinische Screening-Studien für neuartige Impfstoffe und Arzneimittel zur Behandlung von23,24,25.
In diesem Protokoll beschreiben wir wie neuartige Impfstoff Antigen Kandidaten gegen Mycobacteriosis durch die DNA-basierte Impfung von Erwachsenen Zebrafisch ausgewertet werden können. Zunächst beschreiben wir, wie Antigene in der pCMV-EGFP Ausdruck Plasmid, gefolgt von ein detailliertes Protokoll für die intramuskuläre Injektion von Impfstoff Plasmide und die anschließende Electroporation in Muskel geklont werden. Der Ausdruck jedes Antigen wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie einwöchigen Postimmunization bestätigt. Die Wirksamkeit der Antigen-Kandidaten wird dann von experimentell infizieren geimpften Fisch mit M. Marinumgetestet.
Das Verfahren der Immunisierung von Erwachsenen Zebrafisch mit DNA-basierte Impfstoffe erfordert einige technische Expertise. Auch für ein erfahrener Forscher dauert Impfung einen einzigen Fisch ca. 3 min, ausgenommen Vorbereitungen. So kann ein Maximum von ungefähr 100 Fische innerhalb eines Tages geimpft werden. Wenn mehr als 100 Fische für das Experiment benötigt werden, können die Impfungen zwischen bis zu 3 Tage aufgeteilt werden. Neben der Qualität des Experiments ist ausreichendes Training des Researcher(s) für die Handhabung der Fische und Durchführung der Immunisierung wesentlich für das Wohlbefinden der Fische. Achten Sie darauf, lokale rechtliche und Tierschutz Regeln und Richtlinien folgen, wenn es kommt auf die Fische, Planung der Experimente und die Voraussetzungen, die für das Personal, die Durchführung der Experimente.
Zusammenfassend lässt sich sagen gibt es mehrere wichtige Schritte zu Komplikationen in der Immunisierung Protokoll zu vermeiden. Für die erfolgreiche Immunisierung zu gewährleisten, dass 1) die Fische geimpft werden sind gesunde und ausreichende in Alter und Größe (die Impfung mehr Jungfische kann erfordern Verkleinerung der Impfstoff-Volumen und die Elektroporation-Einstellungen); 2) die Fische werden ohne richtig betäubt stärker als 0,02 % 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester, und sie bleiben während des gesamten Verfahrens narkotisierten (Narkose sollte so kurz wie möglich für die Wiederherstellung des Fisches); 3) die Schwamm-Pad ist richtig durchnässt; 4) Flüssigkeit in jedem Impuls von der pneumatischen Pumpe injiziert wird, und wenn nicht, wird die Pulslänge angepasst (zieht die Nadel leicht nach hinten entlang der y-Achse kann helfen); 5) gibt es keine Luftblasen mit dem Impfstoff-Lösung; 6) die Elektroporation-Einstellungen und die tatsächliche Impulsspannung und Länge sind richtig; 7) der Elektroden verursachen keine Hautschäden auf dem Gelände der Elektroporation (während die Elektroporation, halten Sie die Elektroden in sanften Kontakt mit dem Fisch, und lassen Sie den Fisch sofort in den Schmutzwassertank nach Elektroporation).
Es ist wichtig, die Fische nach der Elektroporation in den Schmutzwassertank überwachen und keine Anzeichen von Unbehagen Fische einzuschläfern. Darüber hinaus ist es notwendig, das Verfahren zu üben, bevor Sie beginnen einen Großversuch, um einen fließenden Arbeitsablauf zu gewährleisten. Wenn möglich, bitten Sie einen ausreichend ausgebildeten Kollegen für die Unterstützung bei der Besetzung von den Nadeln und die Elektroporation.
Die DNA-Impfung-Methode ermöglicht die maßgeschneiderte Gestaltung der Impfstoff Antigene. Es ist möglich, das ganze Antigen zu klonen oder vorzugsweise wählen Teile des Antigens basierend auf zelluläre Lokalisation und Immunogenität24. Darüber hinaus ermöglicht die Methode kombinieren mehrere Antigene oder Hilfsstoffe in einem Impfstoff Konstrukt oder mehrere separate Plasmide in der gleichen Zeit2injiziert. Darunter ein Stopcodon nach der Antigen-Sequenz oder das EGFP-gen aus dem Plasmid besteuert ist es möglich, die gleichen Plasmid Vector auch auszudrücken, das Antigen ohne anschließende N-terminale GFP-Tag zu nutzen. Dies kann bei der Bestätigung der positiven Ergebnisse, wie die relativ große Größe der GLP kann beeinflussen die Faltung des Antigens und somit humorale Reaktionen möglicherweise hervorgerufen durch die Impfung beschränken sinnvoll sein.
Eine höhere Antigen-Expression wurde auf DNA-Impfstoff Immunogenität2verbunden. Elektroporation nach Injektion hat, so in diesem Protokoll aufgenommen worden, da sich gezeigt hat, um den Ausdruck von Antigenen oder Reporter-Gene aus um das Vierfache erhöhen im Zebrafisch32zu verzehnfachen. Darüber hinaus führt die Elektroporation als Technik moderate Gewebeverletzungen und veranlassten lokalen Entzündung, der den Impfstoff induzierte Immunantwort2weiter fördert. Auf der anderen Seite ist die Elektroporation allgemein gut verträglich. Mit der Ausrüstung, die hier verwendet wird praktisch 100 % der Erwachsenen Zebrafisch aus sechs Impulsen der 40 V verwendet in diesem Protokoll35gut erholen.
Neben Elektroporation, um den Eintrag des Impfstoff-Plasmids in die Zellen zu verbessern, verwenden wir einen starken allgegenwärtigen Promotor in der Impfstoff-Plasmid und eine PolyA Tail am 3′-Ende des Antigens, um Antigen-Expression in den transfizierten Fisch-Zellen zu verbessern. In einigen Fällen Codon Usage des Ziel-Erregers unterscheidet sich wesentlich von den geimpften Arten wurde Codon Optimierung nützlich bei der weiteren Erhöhung Target gen Ausdruck2gefunden. In diesem Zebrafisch –M. Marinum Modell jedoch Codon Optimierung hatte keinen signifikanten Einfluss auf den Ausdruck Ebenen zweier mykobakteriellen Modell Gene, ESAT-6 und GFP-10, und, so wurde als unnötig in diesem Modell35 .
Gen Ausdruck Zielprofilen haben einige zeitliche Variation zwischen der Antigene, abhängig, zum Beispiel die Größe und die Struktur der Antigene in Frage. Antigen-Ausdruck ist jedoch in der Regel ähnliche innerhalb einer Gruppe von Fischen mit dem gleichen Impfstoff immunisiert. In der Regel die hellsten EGFP Ausdruck wird vier Tage zu einer Woche Postvaccination beobachtet, aber eine Skala von 2 – 10 Tage ist möglich. Es wird empfohlen, den Ausdruck jedes Antigen-EGFP-Fusionsprotein in einer kleinen Gruppe von Fischen (2 – 3) vor Aufnahme des Antigens in einem Großversuch zu validieren. Wenn keine GFP Expression an jedem beliebigen Punkt 2 – 10 Tage nach der Impfung beobachtet wird, stellen Sie sicher, dass 1) die Immunisierung-Protokoll wurde sorgfältig befolgt. Immer eine Gruppe von Fischen mit dem leeren pCMV-EGFP-Plasmid als Positivkontrolle immunisiert und stellen sicher, dass 2) der Antigen-Design und molekularen Klonen wurde korrekt durchgeführt (angemessene besser gekleideteres Design; das Antigen und EGFP Tag sind beide in der gleichen Leseraster sind keine eingreifenden Stop-Codons im Preis inbegriffen). In einigen Fällen, trotz der richtigen Antigen-Design kann GFP erkannt werden. Dies ist möglicherweise aufgrund der fehlerhaften Faltung oder schnellen Zusammenbruch des Fusionsproteins. Unter diesen Umständen ist die Neugestaltung des Antigens erforderlich.
In Impfstoffen, die verwendet werden, um Zuchtfisch zu immunisieren, ist die verwendete Plasmid-Dosis in der Regel 1 µg oder weniger7,33,34. Im Zebrafisch kann auch Reporter-gen-Expression nach mindestens einer 0,5 µg Plasmid Injektion nach Electroporation nachgewiesen werden; Allerdings erhöht sich die relative Ziel Genexpression erheblich mit einer höheren Menge an Plasmid pro Fisch (ergänzende Abbildung1). Fisch mit dem pCMV-EGFP-Reporter-Plasmid injiziert führte zu eine Injektion mit 5 – 20 µg Plasmid in vier bis acht Mal höher EGFP Ebenen im Vergleich zu Fisch mit 0,5 µg gespritzt. Daher, um ein hoch genug Ziel Genexpression zu gewährleisten, dennoch haben Einspritzmengen, die klein genug (≤7 µL) überschüssiges Gewebe beschädigt werden kann oder Impfstoff Leckagen sind, entschieden wir uns, 5 bis 12 µg pro Fisch für die Vorauswahl zu verwenden. Neben der Impfstoff Immunogenität, hohem müssen genügend Ziel Genexpression Reporter-gen-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop und mit western-Blot, zu erkennen ist die erforderlich zu screening-Zwecken die richtige in Vivo bestätigen Übersetzung von das Ziel-Antigen. Jedoch niedrigere Plasmid Dosen (0,5 – 1 µg) kann nützlich sein für andere Arten von experimentellen verwendet.
Abschließend kann dieses Protokoll für die Impfung von Erwachsenen Zebrafisch mit einem Plasmid DNA in der präklinischen Erprobung neuartiger Impfstoffkandidaten gegen verschiedene bakterielle oder virale Infektionen verwendet werden. Der Ausdruck der Impfstoff-Antigen als GFP Fusionsprotein ermöglicht die Visualisierung eines erfolgreichen Immunisierung Event und Antigen Ausdrucks. Wir wenden diese Methode für die präklinische Screening von Roman Antigen Impfstoffkandidaten gegen Tuberkulose. Wir infizieren der Zebrafisch fünf Wochen Postvaccination und bestimmen, dass die Bakterien in jeder Fisch mit qPCR20,24zählt.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind dankbar für die Mitglieder der Arbeitsgruppe Experimentelle Immunologie, und vor allem an Leena Mäkinen und Hannaleena Piippo, für all die Arbeit sie haben getan in der Entwicklung und Optimierung der Impfung Protokoll und ihre Hilfe bei der eigentlichen Experimente unter Verwendung des Protokolls.
Diese Arbeit wurde unterstützt von Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Jane und Aatos Erkko Stiftung; m.r.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Stiftung; m.r.), wettbewerbsfähigen Zustand Forschung Finanzierung der Experte Verantwortungsbereich der Universität Tampere Krankenhaus (, m.r.), mit Tuberkuloosisäätiö (Tampere Tuberkulose Stiftung; m.r., H.M und M.N), Suomen Kulttuurirahasto (finnischen Kulturstiftung; zu HM), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finnische Anti-Tuberkulose Stiftung; zu H.M) Väinö ja Laina Kiven Säätiö (Väinö und Laina Kivi Stiftung; M.N) und der Tampere City Science Foundation (M.N).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |