在这里, 我们描述了一项关于成人斑马鱼 (斑马斑马) 免疫接种的协议, 以 DNA 为基础的疫苗, 并证明了成功的疫苗接种事件的验证。该方法适用于各种感染模型的疫苗候选者的临床前筛选。
在过去的两年中, 对基于 DNA 的疫苗接种的兴趣有所增加。DNA 疫苗接种的基础是克隆选定抗原的序列或将抗原组合成质粒, 从而实现量身定做和安全的设计。DNA 疫苗在宿主细胞中的管理导致抗原的表达, 刺激体液和细胞介导的免疫反应。本报告描述了将抗原序列克隆到 pCMV-EGFP 质粒中的一种协议, 通过肌内显微注射将成人斑马鱼与疫苗候选者进行免疫, 以及随后的电穿孔以改善摄入量。疫苗抗原被表示为绿色荧光蛋白 (GFP) 融合蛋白, 它允许确认在紫外光下的抗原表达在活鱼和定量的表达水平的融合蛋白与 ELISA, 以及他们的检测与西方印迹分析。疫苗候选者的保护作用通过感染鱼与分枝杆菌杆菌五周 postvaccination, 其次是定量的细菌与四周后的 qPCR。与哺乳动物临床前筛选模型相比, 该方法为新的基于 DNA 的疫苗候选分枝杆菌感染的初步筛选提供了一种经济有效的方法。该方法可进一步用于筛选基于 DNA 的疫苗, 针对各种细菌和病毒性疾病。
第一个 dna 疫苗研究是在二十世纪九十年代1进行的, 从那时起, dna 疫苗已经针对各种传染性疾病、癌症、自身免疫和过敏2进行了测试。在哺乳动物中, 一种针对马西尼罗病毒的 DNA 疫苗和用于犬口服黑色素瘤的治疗性癌症疫苗已获得许可, 但目前尚未在临床上使用2。除了哺乳动物研究引起的兴趣外, DNA 疫苗接种已成为一种方便的方法来免疫养殖鱼类抵御病毒性疾病。自2005年以来, 一项针对鱼类传染性造血坏死病毒 (IHNV) 的疫苗已在商业上使用, 而一项针对传染性胰腺坏死病毒 (IPNV) 的疫苗最近获得了3的许可。此外, 还在开发一些针对鱼类病原体的 DNA 疫苗。
由于传统疫苗通常含有灭活或活性减弱的病原体, 因此它们会造成2传染疾病的潜在风险。DNA 疫苗反过来也可以避免这种风险, 因为它们是基于对细菌或病毒抗原进行质粒编码的管理, 而不是整个病原体本身2,4。dna 疫苗是用 dna 重组技术生产的, 这使得疫苗抗原的精确设计和抗原组合和佐剂在单一疫苗结构中的灵活配方5。此外, DNA 疫苗的生产比基于蛋白质的重组疫苗更快、更容易和更具成本效益, 这是疫苗候选筛查的主要优势, 而且, 例如, 在大流行性暴发的情况下2。
在鱼类中, DNA 疫苗最常见的管理途径是腹腔、肌肉和口服3、6、7, 而在哺乳动物中, 皮下和皮内路是额外的选项2。在肌肉注射后, 所管 DNA 质粒进入管理部位 (g., 主要是肌细胞, 但也驻留抗原呈现细胞 [apc]) 中的单元格。电穿孔2、8可显著提高转染细胞的比例。进入细胞后, 一些质粒 DNA 进入细胞核, 其中由质粒编码的基因转录2。在本协议中, 我们利用 pCMV-EGFP 质粒, 它具有强大的无处不在的启动子, 针对真核表达式9进行优化。在这个结构中, 抗原被翻译成融合蛋白与 GFP。GFP 通过荧光显微镜在活鱼中简单地显示抗原表达, 从而确认成功的疫苗接种和正确的抗原产物。
在哺乳动物中, DNA 疫苗被证明可以刺激不同类型的免疫反应, 具体取决于转染的细胞类型2,5。转染的肌细胞将抗原分泌到细胞外空间或释放它们, 然后被 apc 吞噬的抗原随后呈现在主要的相容复合物 II 分子2上。这会触发 CD4 和 CD8 T 细胞响应, 尤其是 B 细胞响应2、5、10。在鱼, T 和 B 淋巴细胞, 以及树突状细胞 (DCs), 已经确定, 但他们的分工在抗原演示中不太清楚11。然而, 斑马鱼 DCs 已被证明与他们的哺乳动物同行分享保守的表型和功能特征12。此外, DNA 疫苗接种已被证明可以在鱼类和哺乳动物中引起类似的免疫反应, 包括 T 和 B 细胞反应6、13、14、15、16.
幼虫和成年斑马鱼都被广泛用于模拟不同的传染病, 如本议定书17、18、19、20 条所用结核杆菌感染模型. ,21,22。与哺乳动物模型生物相比, 斑马鱼的优势包括小尺寸、快速重现性和低住房费用23。这些方面使斑马鱼成为新疫苗和药物化合物的大型临床前筛选研究的理想动物模型23,24,25。
在本协议中, 我们描述了如何利用成人斑马鱼的 DNA 疫苗来评估新的疫苗抗原候选杆菌。首先, 我们描述了抗原是如何被克隆到 pCMV-EGFP 表达质粒中的, 然后是一个详细的协议, 用于肌肉注射疫苗粒度和随后的电穿孔成肌。每抗原的表达通过荧光显微镜证实, 一周 postimmunization。抗原候选的有效性, 然后测试通过实验感染接种的鱼与m. 杆菌。
以 DNA 为基础的疫苗对成人斑马鱼进行免疫的过程需要一些技术专长。即使是有经验的研究员, 接种一条鱼大约需要3分钟, 不包括制剂。因此, 在一天内最多可以接种大约100条鱼。如果实验需要超过100条鱼, 则免疫接种可分为3天。除了实验的质量外, 研究人员对鱼类的处理和免疫接种的充分训练对鱼类的福祉至关重要。确保遵守当地的法律和动物福利规则和指导方针, 当涉及到住房的鱼, 计划的实验, 以及所需的人员进行实验的资格。
总之, 有几个关键步骤, 以避免在免疫协议的复杂化。为成功进行免疫接种, 确保1)要接种的鱼在年龄和大小上都是健康和充足的 (对更多的幼鱼进行免疫可以要求降低疫苗体积和电穿孔设置);2)鱼是正确的麻醉, 没有强于 0.02% 3-苯甲酸酸乙酯, 他们仍然麻醉整个过程中 (麻醉应保持尽可能短, 以确保鱼的恢复);3)海绵垫适当浸泡;4)液体从气动泵中注入每个脉冲, 如果没有, 脉冲长度调整 (沿 y 轴稍微向后拉针可以帮助);5)疫苗解决方案没有气泡;6)电穿孔设置和实际脉冲电压和长度正确;7)电极不会对电穿孔部位造成皮肤损伤 (在电击过程中, 保持电极与鱼的轻柔接触, 并在电穿孔后立即将鱼放进回收池)。
重要的是要监测的鱼后, 在回收池中的电穿孔和安乐死任何迹象显示不舒服的鱼。此外, 在进行大规模实验之前, 必须先练习程序, 以确保流畅的工作流程。如果可能的话, 请一个训练有素的同事来帮助填补针头和电穿孔。
DNA 疫苗接种方法可为疫苗抗原量身定制设计。可以克隆整个抗原或, 优选地, 根据细胞定位和免疫原性24选择抗原的部分。此外, 该方法可以将几个抗原或佐剂组合成一个疫苗结构, 或在同一时间2注射几个单独的质粒。通过在抗原序列后包括一个停止密码子或通过切除从质粒的 EGFP 基因, 它可以利用相同的质粒载体也表达抗原没有随后的 n-末端 GFP 标记。这可能是合理的确认阳性筛查结果, 因为相对较大的 GFP 可能影响抗原的折叠, 从而限制体液反应可能诱发的疫苗接种。
更高的抗原表达已链接到 DNA 疫苗免疫原性2。注射后的电穿孔, 因此, 被列入本议定书, 因为它已被证明增加抗原或报告基因的表达在斑马鱼32。此外, 电穿孔作为一种技术导致中等组织损伤, 从而诱发局部炎症进一步促进疫苗诱发免疫反应2。另一方面, 电穿孔一般耐受性好。在这里使用的设备, 几乎100% 的成人斑马鱼将恢复良好的六脉冲 40 V 使用在本协议35。
除了使用电穿孔提高疫苗质粒进入细胞, 我们使用一个强大无处不在的启动子在疫苗质粒和波利亚尾巴在 3 ‘ 末端的抗原, 以改善在转染的鱼细胞的抗原表达。在某些情况下, 如果目标病原体的密码子使用与接种的物种有显著差异, 密码子优化在进一步增加目标基因表达2中是有用的。然而, 在这条斑马鱼m. 杆菌模型中, 密码子优化对两个分枝杆菌模型基因、 ESAT-6和CFP-10的表达水平没有显著影响, 因此在这个模型中被认为是不必要的35.
靶基因表达谱在抗原之间有一定的时间变化, 具体取决于抗原的大小和结构。然而, 抗原表达通常是相似的在一组鱼类接种同一疫苗。通常, 最亮的 EGFP 表达式被观察四天到一周 postvaccination, 但2–10天的规模是可能的。建议在一小群鱼 (EGFP) 中验证每个抗原————-的融合蛋白的表达, 然后在大规模实验中包括抗原。如果在免疫后的2–10天内没有观察到 GFP 的表达, 请确保1)免疫接种协议被仔细地遵循。始终有一组以空 pCMV EGFP 质粒为阳性对照的鱼类, 并确保2)抗原设计和分子克隆正确进行 (充分的底漆设计; 抗原和 EGFP 标记都在同一读取帧和没有干预停止密码子包括在内)。在某些情况下, 尽管正确的抗原设计, GFP 无法检测到。这可能是由于不正确的折叠或快速分解的融合蛋白。在这种情况下, 可能有必要重新设计抗原。
在用于免疫养殖鱼类的疫苗中, 使用的质粒剂量通常为1µg 或小于7、33、34。在斑马鱼中, 通过电穿孔后至少0.5 µg 质粒注射液也能检测到报告基因的表达;然而, 相对靶基因表达显著增加, 每条鱼的质粒量 (补充图 1)。在用 pCMV-EGFP 报告质粒注射的鱼中, 与注射 0.5 EGFP 的鱼相比, 与5–20µg 的质粒的注射导致的µg 水平高出四至八倍。因此, 为了确保足够高的靶基因表达, 还有足够小的注射量 (≤7µL), 以防止任何过量的组织损伤或疫苗泄漏, 我们选择使用5到12µg 每条鱼为初步筛选目的。除了疫苗免疫原性外, 还需要一个足够高的靶基因表达, 用荧光显微镜和西方印迹检测报告基因的表达, 这对于筛查目的以确认体内是否正确是必要的。目标抗原的翻译。然而, 低质粒剂量 (0.5–1µg) 可用于其他类型的实验用途。
最后, 本议定书的免疫的成人斑马鱼与 DNA 质粒可用于新疫苗候选的临床前测试针对各种细菌或病毒感染。疫苗抗原作为 GFP 融合蛋白的表达允许成功的免疫事件和抗原表达的可视化。我们将此方法应用于新型疫苗抗原候选抗结核的临床前筛选。为此, 我们感染斑马鱼五周 postvaccination, 并确定每条鱼的细菌计数20,24。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢实验免疫学研究组的成员, 特别是莉娜 Mäkinen 和 Hannaleena 卡里, 为他们在制定和优化疫苗接种方案方面所做的一切工作, 以及他们在实际实验中的帮助。使用协议。
这项工作得到了简 ja 阿托斯 Erkon Säätiö (简和阿托斯 Erkko 基金会; 磁共振成像技术), 西格丽德 Juséliuksen Säätiö (西格丽德 Juselius 基金会; 磁共振成像技术), 坦佩雷大学专家责任区竞争性国家研究经费筹措医院 (至磁共振成像技术), 坦佩雷 Tuberkuloosisäätiö (坦佩雷结核病基金会; 磁共振成像技术, 陛下, M.N.), 服务部 Kulttuurirahasto (芬兰文化基金会; 陛下), 服务部 Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen (芬兰抗结核基础陛下), Väinö ja 莱娜 Kiven säätiö (Väinö和莱娜凯威基金会; M.N.) 和坦佩雷城市科学基金会 (M.N.)。
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |