Qui descriviamo un protocollo per l’immunizzazione del adulto zebrafish (Danio rerio) con un vaccino basato su DNA e dimostrare la convalida di un evento di successo vaccinazione. Questo metodo è adatto per lo screening preclinico di candidati vaccinali in vari modelli di infezione.
L’interesse nella vaccinazione basati sul DNA è aumentato durante le due decadi scorse. Vaccinazione del DNA si basa sulla clonazione di una sequenza di un selezionata antigene o una combinazione di antigeni in un plasmide, che consente un design su misura e sicuro. La somministrazione di vaccini a DNA nelle cellule ospiti conduce all’espressione degli antigeni che stimolano la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata. Questo rapporto descrive un protocollo per la clonazione delle sequenze di antigene nel plasmide pCMV-EGFP, l’immunizzazione di zebrafish adulto con vaccini candidati di microiniezione intramuscolare e l’elettroporazione successivo per migliorare l’assunzione. Gli antigeni del vaccino sono espresso come proteina fluorescente verde (GFP)-proteine di fusione, che permette la conferma dell’espressione dell’antigene sotto UV luce da pesci vivi e la quantificazione dei livelli di espressione della proteina di fusione con ELISA, anche come loro rilevazione con un’analisi di western blot. L’effetto protettivo dei candidati vaccino viene testato da infettare il pesce con Mycobacterium marinum postvaccinazione cinque settimane, seguita dalla quantificazione dei batteri con qPCR quattro settimane più tardi. Rispetto ai modelli di screening preclinici mammiferi, questo metodo fornisce un metodo conveniente per lo screening preliminare dei candidati vaccinali basati sul DNA romanzo contro un’infezione micobatterica. Il metodo possa essere applicato a screening basati sul DNA vaccini contro varie malattie batteriche e virali.
I primi studi per vaccino a DNA sono stati effettuati in 1990s1, e da allora, i vaccini del DNA sono stati testati contro varie malattie infettive, cancro, dell’autoimmunità e Allergia2. Nei mammiferi, un vaccino a DNA contro il virus della West Nile nei cavalli e un vaccino terapeutico del cancro per melanoma orale canino sono stati concessi, ma queste non sono attualmente in uso clinico2. Oltre all’interesse evocata dagli studi dei mammiferi, la vaccinazione del DNA ha rivelato per essere un modo conveniente per immunizzare i pesci d’allevamento contro le malattie virali. Un vaccino contro il virus di pesce alla necrosi ematopoietica infettiva (IHNV) è stato in uso commerciale dal 2005, e un vaccino contro il virus della necrosi pancreatica infettiva (IPNV) è stato recentemente autorizzato3. Inoltre, diversi vaccini a DNA contro gli agenti patogeni pesci stanno sviluppandi.
Come vaccini tradizionali spesso contengono agenti patogeni attenuati dal vivo o inattivati, essi rappresentano un rischio potenziale di trasmettere la malattia2. Vaccini a DNA, a sua volta, scongiurare questo rischio, in quanto si basano sulla somministrazione di plasmide che codifica gli antigeni batterici o virali, piuttosto che l’agente patogeno tutta sé2,4. Vaccini a DNA sono prodotte con tecniche di ricombinazione del DNA, che permette il disegno preciso dei vaccini e la formulazione flessibile delle combinazioni di antigene e adiuvanti in un singolo vaccino costrutto5. Inoltre, la produzione di vaccini a DNA è più veloce, più facile e più efficiente di quella di vaccini ricombinanti base di proteine, che è un grande vantaggio per il candidato vaccino ai fini dello screening, ma anche, per esempio, nel caso di focolai di pandemie 2.
Nei pesci, le più comuni vie di somministrazione di vaccini a DNA sono intraperitoneale, intramuscolare e orale3,6,7, mentre nei mammiferi, sottocutanea e intradermiche rotte sono opzioni aggiuntive2. Dopo un’iniezione intramuscolare, i plasmidi di DNA amministrati entrano nelle cellule al luogo di amministrazione (ad es., per lo più miociti, ma anche cellule presentanti l’antigene residenti [APC]). La proporzione di cellule transfected può essere significativamente aumentata di elettroporazione2,8. Dopo aver inserito la cella, alcuni DNA plasmidico entra nel nucleo, dove i geni codificati dal plasmide sono trascritti2. In questo protocollo, utilizziamo il plasmide pCMV-EGFP che ha un forte promotore onnipresente ottimizzato per9di espressione eucariotico. In questo costrutto, gli antigeni sono tradotte come una proteina di fusione con un GFP. La GFP consente la conferma di una vaccinazione di successo e il prodotto corretto antigene mediante la semplice visualizzazione dell’espressione dell’antigene con un microscopio a fluorescenza in pesci vivi.
Nei mammiferi, i vaccini del DNA hanno dimostrati di stimolare diversi tipi di risposte immunitarie a seconda i tipi di cellulari trasfettate2,5. Miociti trasfettate secernono antigeni nello spazio extracellulare o rilasciarli alla morte delle cellule e gli antigeni inghiottiti dalle APC sono, successivamente, ha presentati su istocompatibilità complex II molecole2. Questo genera risposte delle cellule CD4 e CD8 T, in particolare, oltre a cellule B risposte2,5,10. Nei pesci, linfociti T e B, così come le cellule dendritiche (DCs), sono state identificate, ma loro divisione del lavoro nella presentazione dell’antigene è meno ben compreso11. DCs di zebrafish, tuttavia, hanno dimostrato di condividere conservate caratteristiche fenotipiche e funzionali con i loro omologhi dei mammiferi12. Inoltre, la vaccinazione del DNA ha dimostrata di suscitare le risposte immunitarie simili nei pesci e nei mammiferi, compreso le cellule T e B risposte6,13,14,15,16 .
Zebrafish adulti e larve sono ampiamente utilizzati per diverse malattie infettive modello, ad esempio il modello di infezione pesce M. marinum della tubercolosi utilizzato in questo protocollo17,18,19,20 ,21,22. In confronto con organismi di modello dei mammiferi, i vantaggi di zebrafish includono le loro piccole dimensioni, veloce riproducibilità e bassa ospita le spese23. Questi aspetti rendono il pesce zebra modello animale ideale per gli studi di indagine preclinica su vasta scala per i nuovi vaccini e composti farmaceutici23,24,25.
In questo protocollo, descriviamo come romanzo dell’antigene del vaccino candidati contro mycobacteriosis possono essere valutati dalla vaccinazione basati sul DNA di zebrafish adulto. In primo luogo, descriviamo come antigeni sono clonati nel plasmide pCMV-EGFP espressione, seguito da un protocollo dettagliato per l’iniezione intramuscolare di plasmidi di vaccino e l’elettroporazione successiva nel muscolo. L’espressione di ogni antigene è confermata da postimmunization una settimana microscopia di fluorescenza. L’efficacia dei candidati dell’antigene è quindi provata sperimentalmente infettando pesce vaccinati con M. marinum.
La procedura di immunizzare zebrafish adulto con vaccini basati sul DNA richiede alcune competenze tecniche. Anche per un ricercatore esperto, vaccinare un singolo pesce prende circa 3 min., escluse le preparazioni. Così, un massimo di circa 100 pesci possa essere immunizzato entro un giorno. Se più di 100 pesci sono necessari per l’esperimento, le vaccinazioni possono essere diviso tra fino a 3 giorni. Oltre alla qualità dell’esperimento, sufficiente formazione di ricercatori per gestire il pesce ed eseguendo l’immunizzazione è essenziale per il benessere dei pesci. Assicurarsi di seguire le linee guida e regole locali legali e di benessere animale, quando si tratta di alloggiamento il pesce, pianificazione degli esperimenti e le qualifiche richieste per il personale che effettua gli esperimenti.
In sintesi, ci sono diversi passaggi critici per evitare complicazioni nel protocollo di immunizzazione. Per l’immunizzazione di successo, assicurarsi che 1) i pesci saranno immunizzati sono sana e sufficiente in età e le dimensioni (l’immunizzazione dei pesci più giovani possa richiedere la scalatura verso il basso il volume di vaccino e le impostazioni di elettroporazione); 2) il pesce sono adeguatamente anestetizzato con no più forte di 0,02% 3-aminobenzoic estere etilico dell’acido, e rimangono anestetizzati durante tutta la procedura (anestesia dovrebbe essere tenuto più corto possibile garantire il recupero del pesce); 3) il tampone di spugna è correttamente intrisa; 4) liquido viene iniettato in ogni impulso dalla pompa pneumatica e, se non, la lunghezza di impulso è regolata (tirando l’ago leggermente all’indietro lungo l’asse y può aiutare); 5) bolle d’aria con la soluzione di vaccino; 6) le impostazioni di elettroporazione e la tensione di impulso effettivo e la lunghezza sono corrette; 7) gli elettrodi non causano danni alla pelle nel sito di elettroporazione (durante l’elettroporazione, tenere gli elettrodi in dolce contatto con il pesce e rilasciare il pesce immediatamente nel serbatoio di recupero dopo l’elettroporazione).
È importante monitorare il pesce dopo l’elettroporazione nel serbatoio di recupero e di eutanasia qualsiasi pesci che presentano segni di disagio. Inoltre, è necessario praticare la procedura prima di iniziare un esperimento su larga scala, per garantire un flusso di lavoro correntemente. Se possibile, chiedere a un collega sufficientemente addestrato per assistenza con riempimento gli aghi e l’elettroporazione.
Il metodo di vaccinazione del DNA consente la progettazione su misura di antigeni vaccinali. È possibile clonare l’intero antigene o, preferibilmente, selezionare parti dell’antigene basato su cellulare localizzazione e immunogenicità24. Inoltre, il metodo consente la combinazione di diversi antigeni o coadiuvanti nella costruzione di un vaccino o iniettando diversi plasmidi separati al tempo stesso2. Includendo un codone di arresto dopo la sequenza di antigene o asportando il gene EGFP dal plasmide, è possibile utilizzare lo stesso vettore plasmidico anche per esprimere l’antigene senza il cartellino del N-terminale GFP successivo. Questo può essere ragionevole nel confermare i risultati di screening positivo, come le dimensioni relativamente grandi di GFP possono influenzare la piegatura dell’antigene e, quindi, limitare le risposte umorali potenzialmente evocate dalla vaccinazione.
Un’ più alta espressione dell’antigene è stata collegata al DNA vaccino immunogenicità2. Elettroporazione dopo l’iniezione è, quindi, stato incluso in questo protocollo, come è stato dimostrato per aumentare l’espressione di antigeni o di geni reporter da quattro volte a dieci volte in zebrafish32. Inoltre, elettroporazione come tecnica provoca lesione moderata del tessuto, così inducendo l’infiammazione locale che promuove ulteriormente la risposta immunitaria indotta da vaccino2. D’altra parte, l’elettroporazione è generalmente ben tollerato. Con l’attrezzatura utilizzata qui, praticamente 100% di zebrafish adulto recupererà bene dagli sei impulsi di 40 V usato in questo protocollo35.
Oltre a utilizzare l’elettroporazione per migliorare la voce del plasmide vaccino nelle cellule, usiamo un forte promotore onnipresente nel plasmide di vaccino e una coda di polyA all’estremità 3′ dell’antigene per migliorare l’espressione dell’antigene nelle cellule trasfettate pesce. In alcuni casi, se l’uso di codone del patogeno bersaglio differisce da significativamente dalla specie vaccinati, ottimizzazione di codone è stato trovato utile per aumentare ulteriormente la destinazione gene expression2. In questo modello zebrafish –M. marinum tuttavia, codone ottimizzazione ha avuto alcun effetto significativo sui livelli di espressione di due geni micobatterici modello, ESAT-6 e CFP-10 e ha, quindi, stati ritenuti inutili in questo modello35 .
Profili di espressione genica di destinazione hanno qualche variazione temporale tra gli antigeni, a seconda, ad esempio, la dimensione e la struttura degli antigeni in questione. Tuttavia, l’espressione dell’antigene è solitamente simile all’interno di un gruppo di pesci immunizzati con il vaccino stesso. In genere, il più brillante espressione di EGFP è osservato quattro giorni per una settimana postvaccinazione, ma è possibile una scala di 2 – 10 giorni. Si consiglia di convalidare l’espressione della proteina di fusione ogni antigene-EGFP in un piccolo gruppo di pesci (2 – 3) prima di includere l’antigene in un esperimento su larga scala. Se nessuna espressione di GFP è osservata in qualsiasi punto 2 – 10 giorni dopo l’immunizzazione, assicurarsi che 1) il protocollo di immunizzazione è stato seguito con attenzione. Sempre avere un gruppo di pesci immunizzati con il plasmide pCMV-EGFP vuota come controllo positivo e assicurarsi che 2) la progettazione di antigene e clonazione molecolare è stata effettuata correttamente (disegno primer adeguato; l’antigene e il tag EGFP sono entrambi nella stessa struttura di lettura e nessun intervento codoni di stop sono inclusi). In alcuni casi, nonostante la progettazione corretta dell’antigene, GFP non può essere rilevato. Questo può essere dovuto la piegatura errata o la rapida degradazione della proteina di fusione. In queste circostanze, può essere necessario riprogettare l’antigene.
Nei vaccini che sono usati per immunizzare i pesci d’allevamento, la dose di plasmide utilizzata è in genere 1 µ g o meno di33,7,34. In zebrafish, espressione del gene reporter può anche essere rilevato dopo almeno un iniezione di 0,5 µ g plasmide seguendo elettroporazione; Tuttavia, la relativa espressione genica aumenta significativamente con una maggiore quantità di plasmide per pesce (complementare figura 1). In pesci iniettati con il plasmide del reporter EGFP pCMV, un’iniezione con 5 – 20 µ g di plasmide ha provocato quattro a otto volte superiore EGFP livelli rispetto ai pesci iniettati con 0,5 µ g. Di conseguenza, per garantire un’espressione genica abbastanza alto, ma hanno volumi di iniezione che sono abbastanza piccolo (≤ 7 µ l) per evitare qualsiasi danno di tessuto in eccesso o dispersione di vaccino, abbiamo scelto di utilizzare 5 a 12 µ g / pesce per le finalità di screening preliminare. Oltre immunogenicità del vaccino, un alto abbastanza espressione genica è necessaria per rilevare l’espressione del gene reporter con un microscopio a fluorescenza e con western blot, che è necessario ai fini di confermare il corretto in vivo dello screening traduzione dell’antigene bersaglio. Tuttavia, dosi inferiori plasmide (0,5 – 1 µ g) può essere utile per altri tipi di utilizzi sperimentali.
In conclusione, questo protocollo per l’immunizzazione di zebrafish adulto con un plasmide DNA utilizzabile nella sperimentazione preclinica di nuovi vaccini candidati contro varie infezioni batteriche o virali. L’espressione dell’antigene del vaccino come proteina di fusione GFP permette la visualizzazione di un’espressione di evento e l’antigene di successo immunizzazione. Applichiamo questo metodo per lo screening preclinico di candidati di antigene romanzo vaccino contro la tubercolosi. Per questo, abbiamo infettare il postvaccinazione di cinque settimane di zebrafish e determinare che i contenuti batterici in ogni pesce con qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono grati ai membri del gruppo di ricerca immunologia sperimentale, e soprattutto di Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo, per tutto il lavoro che hanno fatto a sviluppare e ottimizzare il protocollo di vaccinazione e il loro aiuto in esperimenti reali utilizzando il protocollo.
Questo lavoro è stato supportato da Jane ja AATO Erkon Säätiö (Jane e Aatos Erkko Foundation; a M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; per M.R.), il finanziamento ricerca competitivo statale della zona esperto responsabilità dell’Università di Tampere Ospedale (a M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tubercolosi Foundation; per M.R., H.M. e M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fondazione culturale finlandese; per H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finlandese anti-tubercolosi Fondazione; a S.M.), ja Väinö Laina Kiven säätiö (Väinö e Laina Kivi Foundation; a M.N.) e la città di Tampere Science Foundation (di M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |