Aqui descrevemos um protocolo para a imunização do adulto peixe-zebra (Danio rerio) com uma vacina baseada em DNA e demonstrar a validação de um evento de sucesso da vacinação. Este método é adequado para o rastreio pré-clínico de candidatos vacinais em vários modelos de infecção.
O interesse na vacinação baseada em DNA aumentou durante as últimas duas décadas. Vacinação de DNA baseia-se sobre a clonagem de uma sequência de um antígeno selecionado ou uma combinação de antígenos em um plasmídeo, que permite que um projeto sob medido e seguro. A administração de vacinas de DNA em células hospedeiras conduz à expressão de antígenos que estimulam respostas de imune humorais e celular mediada. Este relatório descreve um protocolo para a clonagem de sequências de antígeno no plasmídeo pCMV-EGFP, a imunização de adultos do zebrafish com os candidatos de vacina por microinjeção intramuscular e o subsequente electroporation para melhorar a ingestão. Os antígenos da vacina são expressos como proteína verde fluorescente (GFP)-proteínas da fusão, que permite a confirmação da expressão do antígeno sob luz de peixes vivos e a quantificação dos níveis de expressão da proteína de fusão com ELISA, também como UV sua detecção com uma análise ocidental do borrão. O efeito protetor dos candidatos a vacina é testado por infectar os peixes com Mycobacterium marinum postvaccination de cinco semanas, seguido pela quantificação das bactérias com qPCR quatro semanas mais tarde. Em relação aos modelos de rastreio pré-clínico mamíferos, este método fornece um método de baixo custo para o rastreio preliminar dos candidatos de romance vacina baseada em DNA contra uma infecção micobacteriana. O método pode ser aplicado mais de triagem baseado em DNA vacinas contra várias doenças bacterianas e virais.
Os primeiros estudos de vacina de DNA foram realizados na década de 19901, e desde então, as vacinas de DNA foram testadas contra várias doenças infecciosas, câncer, auto-imunidade e alergia2. Nos mamíferos, uma vacina de DNA contra o vírus do Nilo Ocidental em cavalos e uma vacina contra o câncer terapêutico para melanoma oral canino ter sido licenciado, mas estas não estão atualmente em uso clínico2. Além do interesse evocado por estudos de mamíferos, vacinação de DNA se revelou para ser uma maneira conveniente para imunizar contra doenças virais os peixes de viveiro. Uma vacina contra o vírus de peixes necrose hematopoiética infecciosa (IHN) esteve em uso comercial desde 2005, e uma vacina contra o vírus da necrose pancreática infecciosa (IPNV) foi recentemente licenciado3. Além disso, várias vacinas de DNA contra patógenos de peixes estão sendo desenvolvidas.
Como vacinas tradicionais muitas vezes contêm patógenos atenuados inactivados ou ao vivo, eles representam um risco potencial de transmissão da doença2. Vacinas de DNA, por sua vez, evitaram este risco, como eles baseiam-se na administração do plasmídeo codificação antígenos virais ou bacterianos, ao invés do patógeno inteiro em si2,4. Vacinas de DNA são produzidas com técnicas de recombinação de DNA, que permite que o projeto preciso de antígenos da vacina e a formulação flexível de combinações de antígeno e adjuvantes em uma única vacina construção5. Além disso, a produção de vacinas de DNA é mais rápido, mais fácil e mais eficiente do que a de vacinas recombinantes à base de proteína, que é uma grande vantagem para o candidato de vacina fins de triagem, mas também, por exemplo, no caso de surtos de pandemia 2.
Nos peixes, as vias de administração mais comuns para as vacinas de DNA são intraperitoneal, intramuscular e oral3,6,7, enquanto nos mamíferos, subcutâneo e intradérmicas rotas são opções adicionais2. Após uma injeção intramuscular, os Plasmideos DNA administrados digite as células no local da administração (ex., na sua maioria miócitos, mas também células apresentadoras residentes [APCs]). A proporção de células transfectadas pode ser significativamente aumentada por eletroporação2,8. Depois de entrar na célula, um plasmídeo entra no núcleo, onde os genes codificados pelo plasmídeo são transcritos2. Neste protocolo, nós utilizamos o plasmídeo de pCMV-EGFP que tem um forte promotor onipresente otimizado para expressão eucarióticos9. Nesta construção, os antígenos são traduzidos como uma proteína de fusão com a GFP. O GFP permite a confirmação de uma vacinação bem sucedida e o produto correto do antígeno pelo simples visualização da expressão do antígeno com um microscópio de fluorescência em peixes vivos.
Nos mamíferos, as vacinas de DNA foram mostradas para estimular diferentes tipos de respostas imunes, dependendo os tipos de células transfectadas2,5. Miócitos transfectados secretam antígenos no espaço extracelular ou soltá-los em cima de morte celular, e os antígenos tragados por APCs, posteriormente, apresentam-se em moléculas II de complexo principal de histocompatibilidade2. Isso desencadeia respostas de células CD4 e CD8 T, especialmente, além de respostas de células B2,5,10. Em peixes, linfócitos T e B, bem como as células dendríticas (DCs), foram identificadas, mas sua divisão do trabalho na apresentação de antigénios é menos bem compreendida11. Zebrafish DCs, no entanto, foram mostrados para compartilhar características fenotípicas e funcionais conservadas com suas contrapartes mamíferos12. Além disso, a vacinação de DNA tem sido mostrada para eliciar respostas semelhantes de imune em peixes e em mamíferos, incluindo T e células B respostas6,13,14,15,16 .
Tanto as larvas e adulto zebrafish são amplamente utilizados para diferentes doenças infecciosas de modelo, como o modelo de infecção de M. marinum peixe de tuberculose, usado no presente protocolo17,18,19,20 ,21,22. Em comparação com os organismos modelo de mamíferos, as vantagens do zebrafish incluem seu tamanho pequeno, rápida reprodutibilidade e despesas23de habitação de baixa. Estes aspectos fazem o zebrafish ideal modelo animal para estudos de triagem pré-clínicos em larga escala de vacinas novas e compostos farmacêuticos23,24,25.
Neste protocolo, descrevemos como romance do antígeno de vacina candidatos contra micobacteriose podem ser avaliados pela vacinação baseada em DNA de adultos do zebrafish. Primeiro, descrevemos como antígenos são clonados no plasmídeo de expressão pCMV-EGFP, seguido por um protocolo detalhado para a injeção intramuscular de plasmídeos de vacina e o electroporation subsequente em músculo. A expressão de cada antígeno é confirmada pelo postimmunization de uma semana de microscopia de fluorescência. A eficácia dos candidatos do antígeno é então testada experimentalmente infectando peixes vacinados com M. marinum.
O procedimento de imunizar adulto zebrafish com vacinas baseadas em DNA requer alguns conhecimentos técnicos. Mesmo para um pesquisador experiente, vacinar um único peixe leva cerca de 3 min, excluindo os preparativos. Assim, um máximo de cerca de 100 peixes pode ser imunizado dentro de um dia. Se mais de 100 peixes são necessários para o experimento, as imunizações podem ser divididas entre até 3 dias. Além da qualidade da experiência, formação suficiente do investigador para lidar com os peixes e realizar a imunização é essencial para o bem-estar dos peixes. Certifique-se de seguir as orientações e regras de bem-estar animal e jurídica local quando se trata de habitação o peixe, as experiências e as qualificações requeridas para o pessoal de realizar as experiências de planejamento.
Em resumo, há vários passos críticos para evitar complicações no protocolo de imunização. Para a imunização bem-sucedida, certifique-se que 1) o peixe para ser imunizado é suficientes e saudáveis em idade e tamanho (a imunização de mais juvenis pode exigir para baixo-escala, o volume de vacina e as configurações de eletroporação); 2) os peixes são devidamente anestesiados com não mais forte do que 0,02% 3-aminobenzoico ácido etil ester, e eles permanecem anestesiados durante todo o procedimento (anestesia deve ser mantida tão curta quanto possível garantir a recuperação dos peixes); 3) a almofada de esponja é devidamente ensopada; 4) líquido é injetado em cada pulso da bomba pneumática e, se não, o comprimento do pulso é ajustado (puxando a agulha levemente para trás ao longo do eixo y pode ajudar); 5) há nenhuma bolha de ar com a solução de vacina; 6) as configurações de eletroporação e a tensão de pulso real e comprimento estão corretas; 7) os eléctrodos não causam danos à pele no site electroporation (durante a eletroporação, manter os eletrodos em suave em contato com o peixe e libertar os peixes imediatamente para o tanque de recuperação após a eletroporação).
É importante para monitorar os peixes após a eletroporação no tanque de recuperação e a eutanásia em qualquer peixe mostrando sinais de desconforto. Além disso, é necessário praticar o procedimento antes de iniciar um experimento em grande escala, para assegurar um fluxo de trabalho fluente. Se possível, pedi ajuda com as agulhas e a eletroporação de enchimento um colega suficientemente treinado.
O método de vacinação de DNA permite que o projeto sob medido de antígenos da vacina. É possível clonar o antígeno todo ou, de preferência, selecionar partes do antígeno com base no celular localização e imunogenicidade24. Além disso, o método permite combinar vários antígenos ou adjuvantes na construção de uma vacina ou injetando vários plasmídeos separados no mesmo tempo2. Incluindo um códon de parada após a sequência de antígeno ou excisão do gene EGFP o plasmídeo, é possível utilizar o mesmo vetor do plasmídeo também para expressar o antígeno sem a marca N-terminal GFP subsequente. Isto pode ser razoável em confirmar os resultados do rastreio positivo, como o tamanho relativamente grande de GFP pode afetar a dobradura do antígeno e, assim, restringir respostas humorais potencial evocadas pela vacinação.
Uma maior expressão do antígeno tem sido associada a de imunogenicidade de vacina de DNA2. Electroporation após a injeção, assim, foi incluído no presente protocolo, como tem sido mostrado para aumentar a expressão de antígenos ou genes repórter de quatro vezes em dez vezes no zebrafish32. Além disso, eletroporação como uma técnica provoca lesão tecidual moderada, induzindo assim a inflamação local que mais promove as respostas de imune induzida pela vacina2. Por outro lado, eletroporação é geralmente bem tolerada. Com o equipamento usado aqui, praticamente 100% dos adultos do zebrafish irá se recuperar bem os seis pulsos de 40 V, usado no presente protocolo35.
Além de eletroporação para realçar a entrada do plasmídeo a vacina dentro das células, utilizamos um forte promotor onipresente no plasmídeo de vacina e uma cauda polyA na extremidade 3′ do antígeno para melhorar a expressão do antígeno nas células transfectadas peixe. Em alguns casos, se o uso de códon do patógeno alvo difere significativamente da espécie vacinada, otimização de códon foi encontrada útil em mais aumento de expressão de gene alvo2. Neste modelo de zebrafish –M. marinum , no entanto, otimização de códon não teve nenhum efeito significativo sobre os níveis de expressão de dois genes modelo micobacteriana, ESAT-6 e 10-PCP e, assim, considerou-se desnecessário neste modelo35 .
Perfis de expressão de gene alvo tem alguma variação temporal entre os antígenos, dependendo, por exemplo, o tamanho e a estrutura dos antígenos em questão. No entanto, a expressão do antígeno é geralmente semelhante dentro de um grupo de peixes imunizados com a mesma vacina. Normalmente, a mais brilhante expressão EGFP observa-se quatro dias para postvaccination de uma semana, mas numa escala de 2-10 dias é possível. É recomendável para validar a expressão da proteína de fusão cada antígeno-EGFP em um pequeno grupo de peixes (2 – 3) antes de incluir o antígeno em um experimento em grande escala. Se nenhuma expressão de GFP é observada em qualquer ponto 2 – 10 dias após a imunização, certifique-se de que 1) o protocolo de imunização foi seguido com atenção. Sempre tem um grupo de peixes imunizadas com o plasmídeo vazio pCMV-EGFP como um controle positivo e certifique-se de que 2) o antígeno design e clonagem molecular foi realizada corretamente (projeto da primeira demão adequada; o antígeno e a tag EGFP estão ambos na mesma frame de leitura e não códons de parada intermediárias estão incluídos). Em alguns casos, apesar do design correto do antígeno, GFP não pode ser detectado. Isto pode ser devido à incorrecta ou avaria rápida da proteína de fusão. Nestas circunstâncias, pode ser necessário redesenhar o antígeno.
Nas vacinas que são usadas para imunizar os peixes de viveiro, a dose de plasmídeo utilizada é tipicamente 1 µ g ou menos de33,7,34. No zebrafish, expressão do gene repórter também pode ser detectado após pelo menos uma injeção de plasmídeo de 0,5 µ g seguindo electroporation; no entanto, a expressão do gene alvo relativa aumenta significativamente com uma maior quantidade de plasmídeo por peixe (complementar a Figura 1). Em peixes injetados com o plasmídeo do repórter pCMV-EGFP, uma injeção com 5-20 µ g de plasmídeo resultou em quatro a oito vezes maior EGFP níveis em comparação com peixe injetado com 0,5 µ g. Portanto, para garantir uma expressão do gene alvo alto o suficiente, ainda têm volumes de injeção que são pequeno o suficiente (≤7 µ l) para evitar qualquer dano de tecido em excesso ou vazamento de vacina, escolhemos usar 5 a 12 µ g por peixe para os fins do exame preliminar. Além de imunogenicidade da vacina, uma alta suficiente expressão do gene alvo é necessário para detectar a expressão do gene repórter, com um microscópio de fluorescência e com o borrão ocidental, que é necessário para a seleção de efeitos para confirmar o correto na vivo Tradução do antígeno alvo. No entanto, doses menor plasmídeo (0,5 – 1 µ g) pode ser útil para outros tipos de usos experimentais.
Em conclusão, este protocolo para a imunização de adultos do zebrafish com um plasmídeo de DNA pode ser usado em testes pré-clínicos de candidatos romance vacina contra várias infecções bacterianas ou virais. A expressão do antígeno de vacina como uma proteína GFP-fusão permite a visualização de uma expressão de evento e antígeno de imunização bem-sucedida. Nós aplicamos esse método para o rastreio pré-clínico de candidatos de antígeno de nova vacina contra a tuberculose. Por isso, nós infectar o postvaccination de cinco semanas de zebrafish e determinar que o bacteriano conta em cada peixe com qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos membros do grupo de pesquisa de Imunologia Experimental, e especialmente a Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo, por todo o trabalho que fizeram no desenvolvimento e otimizando o protocolo de vacinação e a ajuda em experiências reais usando o protocolo.
Este trabalho foi apoiado pela Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Jane e Aatos Erkko Foundation; a M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; para M.R.), a pesquisa de estado competitiva financiamento da área de responsabilidade do especialista da Universidade de Tampere Hospital (M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Fundação de tuberculose de Tampere; para M.R., hm e M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Fundação Cultural finlandesa; para H.M), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finlandês anti-tuberculose Fundação; a H.M), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö e Laina Kivi Foundation; de M.N.) e a Fundação de ciência de cidade de Tampere (a M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |