Hier beschrijven we een protocol voor de immunisatie van de volwassen zebravissen (Danio rerio) met een op basis van DNA vaccin en de validatie van een succesvolle vaccinatie evenement aan te tonen. Deze methode is geschikt voor de preklinische screening van vaccin kandidaten in verschillende modellen van de infectie.
De belangstelling voor DNA gebaseerde vaccinatie is toegenomen tijdens de afgelopen twee decennia. DNA vaccinatie is gebaseerd op het klonen van een opeenvolging van een geselecteerde antigeen of een combinatie van antigenen in een plasmide, waarmee een ontwerp op maat en veilig. Het beheer van DNA-vaccins in cellen van de gastheer leidt tot de uitdrukking van antigenen die zowel de humorale als de cel-gemedieerde immuun reacties stimuleren. Dit verslag beschrijft een protocol voor het klonen van antigeen sequenties in de pCMV-EGFP plasmide, de immunisatie van volwassen zebrafish met de kandidaten van de vaccin door intramusculaire microinjection, en de daaropvolgende electroporation ter verbetering van de inname. De vaccin-antigenen worden uitgedrukt als de groen fluorescente proteïne (GFP)-fusie-eiwitten, waardoor de bevestiging van de antigeen-expressie onder UV-licht van levende vis en de kwantificering van de niveaus van de expressie van de fusieproteïne met ELISA, zo goed als hun detectie met een westelijke vlekkenanalyse. Het beschermende effect van de kandidaten van het vaccin is getest door het infecteren van de vis met Mycobacterium marinum vijf weken postvaccination, gevolgd door de kwantificering van de bacteriën met qPCR vier weken later. Ten opzichte van zoogdieren preklinische screening modellen, biedt deze methode een voordelige methode voor de oriënterende van kandidaten van de nieuwe DNA-gebaseerd vaccin tegen een mycobacteriële infecties. De methode kan verder worden toegepast om te screenen op basis van DNA vaccins tegen verschillende bacteriële en virale ziekten.
De eerste DNA vaccin studies werden uitgevoerd in de jaren 1990-1, en sindsdien, DNA-vaccins tegen diverse besmettelijke ziekten, kanker, autoimmuniteit en allergie2zijn getest. Bij zoogdieren, een DNA-vaccin tegen West-Nijlvirus bij paarden en een therapeutische kanker vaccin voor canine mondelinge melanoom in licentie is gegeven, maar deze zijn momenteel niet in klinische gebruik2. Naast het belang opgeroepen door zoogdieren studies, heeft DNA vaccinatie bleek te zijn een handige manier om te immunizeren gekweekte vis tegen virusziekten. Een vaccin tegen vis infectieuze hematopoïetische necrose virus (IHNV) is in commercieel gebruik sinds 2005, en een vaccin tegen infectieuze alvleesklier necrose virus (IPNV) was onlangs licentie3. Bovendien worden verschillende DNA-vaccins tegen vis ziekteverwekkers ontwikkeld.
Zoals traditionele vaccins vaak geïnactiveerde of levende verzwakte ziekteverwekkers bevatten, vormen ze een potentiële risico van overdracht van de ziekte-2. DNA-vaccins, voorkomen op zijn beurt, dit risico, omdat ze gebaseerd zijn op het beheer van de plasmide codering bacteriële of virale antigenen, in plaats van de hele pathogen zelf2,4. DNA-vaccins worden geproduceerd met DNA recombinatie technieken, waarmee het nauwkeurige ontwerp van vaccin-antigenen en het flexibel opstellen van antigeen combinaties en hulpstoffen in een enkel vaccin construct5. Bovendien is de productie van DNA-vaccins is sneller, gemakkelijker en meer kosten-efficiënter dan die van op basis van eiwitten recombinante vaccins, die is een groot voordeel voor vaccin kandidaat screeningonderzoek, maar ook bijvoorbeeld bij het uitbreken van de pandemie 2.
In vis, de meest voorkomende administratie routes voor DNA-vaccins zijn intraperitoneaal, intramusculaire en mondelinge3,6,7, terwijl bij zoogdieren, subcutane en intradermale routes zijn extra opties2. Na een intramusculaire injectie, de beheerde DNA-plasmiden Voer de cellen bij de beheersite (bv., meestal myocytes, maar ook resident antigeen-presenteren cellen [APCs]). Het aandeel van transfected cellen kan aanzienlijk worden verhoogd door electroporation2,8. Na het invoeren van de cel, komt sommige plasmide DNA de kern, waar zijn de genen gecodeerd door de plasmide getranscribeerde2. In dit protocol gebruiken we de pCMV-EGFP plasmide die een sterke alomtegenwoordige promotor geoptimaliseerd voor eukaryoot expressie9 heeft. In deze constructie, worden de antigenen vertaald als een fusieproteïne met een GFP. Het GFP waardoor de bevestiging van een succesvolle vaccinatie en het juiste antigeen-product door het eenvoudige visualisatie van antigeen expressie met een fluorescentie Microscoop in levende vis.
Bij zoogdieren, zijn DNA-vaccins aangetoond te stimuleren van verschillende soorten immuunresponsen afhankelijk van de transfected cel typen2,5. Transfected myocytes afscheiden van antigenen in de extracellulaire ruimte of vrij te laten op de dood van de cel, en de antigenen opgeslokt door APCs zijn, vervolgens gepresenteerd op grote histocompatibility complex II moleculen2. Dit triggert CD4 en CD8 T cel reacties, vooral naast B-cel reacties2,5,10. In vis, zijn T en B-lymfocyten, evenals dendritische cellen (DC’s), geïdentificeerd, maar hun verdeling van de arbeid in antigeen presentatie minder goed begrepen11 is. Zebravis DCs, echter hebben aangetoond dat de geconserveerde fenotypische en functionele kenmerken delen met hun tegenhangers van de zoogdieren12. Bovendien, DNA vaccinatie is aangetoond dat het uitlokken van soortgelijke immuunresponsen in vissen en zoogdieren, met inbegrip van T en B-cel reacties6,13,14,15,16 .
Zowel de larven als de volwassen zebrafish worden veel gebruikt voor model verschillende infectieziekten, zoals de vis M. marinum infectie model van tuberculose gebruikt in dit protocol17,18,19,20 ,21,22. In vergelijking met zoogdieren modelorganismen, de voordelen van zebravis omvatten hun kleine omvang, snelle reproduceerbaarheid, en lage kosten23huisvesting. Deze aspecten maken de zebravis een ideale diermodel voor grootschalig preklinisch onderzoek studies voor nieuwe vaccins en farmaceutische stoffen23,24,25.
In dit protocol beschrijven we hoe roman vaccin antigeen kandidaten tegen mycobacteriosis kunnen worden geëvalueerd door de DNA gebaseerde vaccinatie van volwassen zebrafish. Eerst beschrijven we hoe antigenen zijn gekloond in de pCMV-EGFP expressie plasmide, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor de intramusculaire injectie van vaccin plasmiden en de daaropvolgende electroporation in spier. De expressie van elk antigeen wordt bevestigd door fluorescentie microscopie één week postimmunization. De werkzaamheid van het antigeen wordt vervolgens getest door experimenteel infecteren gevaccineerde vis met M. marinum.
De procedure voor het immuniseren van volwassen zebrafish met DNA-gebaseerde vaccins moet enkele technische expertise. Zelfs voor een ervaren onderzoeker neemt vaccinatie van een enkele vis ongeveer 3 min, met uitzondering van preparaten. Zo kan een maximum van ongeveer 100 vissen worden geïmmuniseerd binnen een dag. Als meer dan 100 vissen vereist voor het experiment zijn, kunnen de inentingen worden verdeeld tot 3 dagen. Naast de kwaliteit van het experiment is voldoende opleiding van de onderzoeker (s) voor behandeling van de vis en het uitvoeren van de immunisatie essentieel voor het welzijn van de vissen. Zorg ervoor dat lokale juridische en dierenwelzijn regels en richtlijnen volgen als het gaat om de huisvesting van de vissen, van plan de experimenten, en de kwalificaties die vereist zijn voor het personeel tot de proeven.
Kortom zijn er verschillende kritische stappen om complicaties in het protocol van immunisatie te vermijden. Voor de succesvolle immunisatie, zorgt ervoor dat 1) de vis te worden geïmmuniseerd zijn gezond en voldoende in leeftijd en grootte (de immunisatie van meer jonge vis kan vereisen down-schalen de vaccin-volume en de electroporation-instellingen); 2) de vis zijn goed verdoofd met nee sterker dan 0,02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester, en ze blijven gedurende de hele procedure narcose (verdoving moeten zo kort mogelijk het herstel van de vis te waarborgen); 3) de spons pad is goed doorweekt; 4) vloeistof wordt geïnjecteerd in elke puls van de Pneumatische pomp en, zo niet, de impulslengte is aangepast (trekken van de naald iets naar achteren langs de y-as kan helpen); 5) er zijn geen luchtbellen met de oplossing van het vaccin; 6) de electroporation-instellingen en de werkelijke puls spanning en lengte kloppen; 7) de elektroden veroorzaken geen schade van de huid op de site van electroporation (tijdens de electroporation, houd de elektroden in zacht contact met de vis, en laat de vis onmiddellijk in de tank herstel na electroporation).
Het is belangrijk te volgen van de vis na de electroporation in de tank herstel en te euthanaseren geen vis tekenen van ongemak. Bovendien is het noodzakelijk om de praktijk van de procedure voordat u begint een grootschalige experiment, om te zorgen voor een vloeiend workflow. Indien mogelijk, een onvoldoende opgeleide collega te vragen voor hulp bij het invullen van de naalden en de electroporation.
De methode van de DNA-vaccinatie kunt de op maat gemaakte ontwerp van vaccin-antigenen. Het is mogelijk om clone de hele antigeen of, bij voorkeur, het selecteren van delen van het antigeen op basis van cellulaire lokalisatie en immunogeniciteit24. Bovendien is de methode kan verschillende antigenen of hulpstoffen samenvoegen met één vaccin construct of injecteren van verscheidene afzonderlijke plasmiden op de dezelfde tijd2. Door met inbegrip van een stop codon na de antigeen-reeks of door het EGFP-gen van de plasmide middendoor, is het mogelijk om gebruik te maken van de dezelfde plasmide vector ook om uit te drukken van het antigeen zonder de volgende N-terminale GFP-tag. Het is mogelijk dat dit redelijk bij de bevestiging van de resultaten van positieve screening, als de relatief grote omvang van GFP kan van invloed zijn op de vouwen van het antigeen en, dus, humorale reacties potentieel opgeroepen door de vaccinatie beperken.
Een hogere antigeen-expressie is gekoppeld aan DNA-vaccin immunogeniciteit2. Electroporation na injectie, dus, is opgenomen in dit protocol, zoals het is aangetoond dat de expressie van de antigenen en reporter genen van verviervoudiging verhogen tot vertienvoudigd in zebrafish32. Bovendien, electroporation als een techniek zorgt ervoor dat matige weefsel schade, dus inducerende lokale ontsteking die verder de vaccin-geïnduceerde immuunreacties2 bevordert. Aan de andere kant, is electroporation over het algemeen goed verdragen. Met de hier gebruikte apparatuur, zal vrijwel 100% van de volwassen zebrafish herstellen goed van de zes pulsen van 40 V gebruikt in dit protocol35.
Naast electroporation ter verbetering van de vermelding van de plasmide vaccin in de cellen, gebruiken we een sterke alomtegenwoordige promotor in het vaccin plasmide en een staart polyA eind 3′ van het antigeen te verbeteren van antigeen expressie in de cellen transfected vis. In sommige gevallen, indien het codon gebruik van de ziekteverwekker doel aanzienlijk van de gevaccineerde soorten verschilt, is codon optimalisatie gevonden nuttig in het verder verhogen van doel gene expression2. In dit zebrafish –M. marinum model, echter codon optimalisatie hadden geen significant effect op de niveaus van de expressie van twee mycobacteriële model genen, ESAT-6 en GVB-10, en is, dus in dit model35 onnodig geacht .
Gen expressie zoekprofielen hebben sommige temporele variatie tussen de antigenen, afhankelijk van, bijvoorbeeld, de grootte en de structuur van de antigenen in kwestie. Antigeen expressie is echter meestal soortgelijke binnen een groep vis geïmmuniseerd met het zelfde vaccin. Typisch, de helderste expressie van EGFP vier dagen aan één week postvaccination wordt waargenomen, maar een schaal van 2-10 dagen is mogelijk. Het is aanbevolen om het valideren van de expressie van elk antigeen-EGFP fusieproteïne in een kleine groep van vis (2-3) voordat het antigeen in een grootschalig experiment. Indien geen GFP-expressie wordt waargenomen op elk gewenst moment 2-10 dagen na immunisatie, zorg ervoor dat 1) het protocol immunisatie werd zorgvuldig gevolgd. Altijd een groep vis geïmmuniseerd met de lege pCMV-EGFP plasmide als positieve controle hebt en zorg ervoor dat 2) de antigeen-ontwerp en het moleculaire klonen correct werd uitgevoerd (voldoende primer ontwerp; het antigeen en de EGFP tag zijn beide in hetzelfde leesraam en geen tussenliggende stop codonen zijn inbegrepen). In sommige gevallen, ondanks de juiste antigeen ontwerp, kan niet GFP worden gedetecteerd. Dit kan worden veroorzaakt door de onjuiste vouwen of snelle verdeling van de fusie-eiwit. In deze omstandigheden kan het nodig om herontwerp van het antigeen zijn.
In vaccins die worden gebruikt voor het immuniseren van gekweekte vis, is de dosis van de plasmide gebruikt meestal 1 µg of minder7,33,34. In zebrafish, kan verslaggever genexpressie ook worden gedetecteerd na minstens een 0,5 µg plasmide injectie na electroporation; echter, de relatieve doel genexpressie aanzienlijk verhoogt met een hoger bedrag van plasmide per vis (aanvullende figuur 1). In vis ingespoten met de pCMV-EGFP verslaggever plasmide, een injectie met 5 – 20 µg van plasmide geresulteerd in vier tot acht keer hoger EGFP niveaus ten opzichte van de vissen met 0,5 µg geïnjecteerd. Daarom, om te zorgen voor een hoog genoeg doel genexpressie, maar hebben injectie volumes die zijn klein genoeg (≤7 µL) ter voorkoming van weefselschade van de overtollige of vaccin lekkage, kozen we voor 5 tot 12 µg per vis voor doeleinden te gebruiken de oriënterende. Naast vaccin immunogeniciteit, een hoog genoeg doel genexpressie is nodig voor de detectie van verslaggever genexpressie met een fluorescentie Microscoop en westelijke vlek, die noodzakelijk is voor doeleinden te bevestigen de juiste in vivo screening vertaling van het target-antigeen. Echter lager plasmide doses (0,5 – 1 µg) nuttig kan zijn voor andere soorten experimentele toepassingen.
Kortom, kan dit protocol voor de immunisatie van volwassen zebrafish met een DNA plasmide worden gebruikt bij het preklinische testen van kandidaten van de roman vaccin tegen verschillende bacteriële of virale infecties. De uitdrukking van het vaccin antigeen als een GFP-fusieproteïne staat de visualisatie van een succesvolle immunisatie gebeurtenis en antigeen-expressie. Wij hanteren deze methode voor de preklinische screening van roman vaccin antigeen kandidaten tegen tuberculose. Hiervoor, we infecteren de zebravis vijf weken postvaccination en bepalen dat de bacteriële telt in elke vis met qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn dankbaar aan de leden van de onderzoeksgroep experimentele immunologie, en met name aan Leena Mäkinen en Hannaleena Piippo, voor al het werk dat zij hebben verricht in het ontwikkelen en optimaliseren van het vaccinatie protocol en hun hulp in werkelijke experimenten met behulp van het protocol.
Dit werk werd gesteund door Jane ja ihmissusi Erkon Säätiö (Jane en ihmissusi Erkko Foundation; naar M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Stichting; M.R.), de concurrerende staat onderzoeksfinanciering van het gebied van de deskundige verantwoordelijkheid van Tampere University Ziekenhuis (naar M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberculose Foundation; M.R., H.M., en M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Finse Cultural Foundation; H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (Fins tegen tuberculose Stichting; aan H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö en Laina Kivi Foundation; aan M.N.) en de Tampere stad Science Foundation (M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |