Evaluación de la inclusión del exón inducido por empalme conmutación oligonucleótidos antisentidos en fibroblastos del paciente de SMA
Summary
Diferentes oligonucleótidos antisentidos (AONs) han demostrado para inducir la inclusión del exón (modulación de empalme) y rescatar la expresión de SMN para atrofia muscular espinal (SMA). Aquí, describimos un protocolo para AON lipotransfection inducir la inclusión del exón del gen SMN2 y los métodos de evaluación para determinar la eficacia de fibroblastos pacientes SMA.
Abstract
Atrofia muscular espinal (SMA), una enfermedad neurológica letal causada por la pérdida de SMN1, presenta un caso único en el campo de oligonucleótidos antisentido (AON)-mediada por la terapia. Mientras que las mutaciones de SMN1 son responsables de la enfermedad, AONs dirigidos a sitios de silenciador (ISS) empalme intronic de SMN2, incluyendo nusinersen aprobado por la FDA, han demostrado restablecer la expresión de SMN y mejorar los síntomas. Actualmente, muchos estudios en terapia AON para SMA se centran en investigar nuevos químicos AON contra de SMN2 que pueden ser más eficaces y menos tóxicos que nusinersen. Aquí, describimos un protocolo para la evaluación en vitro de la inclusión del exón mediante lipotransfection de AONs seguida de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y Western blot. Este método se puede emplear varios tipos de químicos AON. Usando este método, demostramos que AONs compuesta de los ácidos nucleicos bajo llave alternados (LNAs) y nucleótidos de ADN (ADN LNA mixmers) conducen a la eficiente inserción del exón de SMN2 y restauración de proteína SMN en una concentración muy baja y por lo tanto, el LNA / Oligonucleótidos antisentido basados en mixmer de ADN pueden ser una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento de empalmes defectos causados por enfermedades genéticas. El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varias nuevas AONs.
Introduction
Atrofia muscular espinal (SMA) es un desorden neuromuscular fatal heredado en un patrón recesivo de un autosoma. Se caracteriza por la degradación de las neuronas motoras y progresiva tronco y extremidad músculo parálisis1,2. La mayoría de ocurrencias de SMA son debido a una mutación homocigótica en el gen de supervivencia de motor neuron 1 (SMN1)3. El gen de la supervivencia de la neurona de motor 2 (SMN2) es una copia inversa de SMN1y tiene una secuencia casi idéntica difieren por sólo cinco bases4,5. Una transición de C a T en SMN2 situada en el exón 7 hace que el gen casi no funcional porque la mutación conduce al esencial exón 7 excluidos en casi el 90% de las transcripciones de SMN2 (figura 1a). MRNAs de SMN2 falta exón 7 no puede compensar la función de SMN1 porque su producto de la proteína es inestable y se degrada rápidamente.
Terapia antisentida recientemente emergido como una estrategia muy prometedora para el tratamiento de SMA6. La reciente aprobación del nusinersen por la U.S. Food y Drug Administration (FDA) hizo el primer fármaco disponible para el tratamiento de SMA7. Nusinersen es un oligonucleótido antisentido (AON) de 18-mer con una modificación de 2 ‘-O-methoxyethyl (MOE) y una columna vertebral fosfotioato. La droga apunta silencioso intronic splicing N1 (ISS-N1) localizado en el intrón 7 del gen SMN2 . Enlace de nusinersen al ISS-N1 promueve la recuperación de la expresión de proteína SMN integral funcional del gen SMN2 endógeno mediante la inducción de exón 7 inclusión (figura 1a)8,9,10 . Actualmente, muchos estudios con terapia AON para SMA se centran en investigar nuevos químicos AON que pueden ser más eficaz y menos tóxica que la nusinersen. Se ha demostrado que AONs con otros químicos inducen también eficaz inclusión del exón en el exón 7 de SMN2 tanto in vitro e in vivo11,12,13.
Ácidos nucleic bloqueados (LNAs) son análogos de RNA químicamente modificados que contiene un puente de metileno entre el 4′ –carbono 2′ –oxígeno dentro de la estructura (figura 1b) de furanose14,15. En comparación con DNAs o RNAs, LNAs tienen una mayor afinidad por la Unión a secuencias de ARN complementarias y tienen la ventaja de ser altamente resistente a nucleasas endógenas. La química LNA se ha aplicado para el uso como sondas en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) y en qPCR16,17. También, se utiliza para regular la expresión génica in vitro e in vivo. GapmeR AONs son una combinación de las moléculas de ADN monocatenario flanqueado por varios LNAs en los extremos 5′ y 3′. Golpean hacia abajo de la expresión génica mediante la Unión complementarias a mRNAs específicos, causando que se degrada por la Rnasa H activado18. Mixmers LNA ADN son AONs que se componen de nucleótidos de ADN integrados entre LNAs. En esta orientación puede enlazar miRNA para inhibir su función (LNA-antimiR)19. Algunos antimiRs de LNA han alcanzado desarrollo clínico. Por ejemplo, miravirsen (AntimiR-122) es un LNA antimiR que inhibe miR-122 para tratar la infección por hepatitis C y varios ensayos clínicos de fase II son actualmente19,20. Recientemente, se ha demostrado que mixmers LNA ADN puede modular también RNA splicing21. Puede enlazar una secuencia específica del mRNA e inducir el exón que salta en dystrophin mRNA y el exón inclusión en SMN2 mRNA en vitro13,22.
En este artículo, describiremos una metodología para la inducción de la inclusión del exón utilizando AONs y la evaluación de la eficacia en los niveles de RNA y proteínas. Para ejemplificar este método, se utilizó el mixmers LNA ADN a ISS-N1 en el intrón 7 de SMN2. AONs transfectadas en las células de pacientes SMA por lipotransfection inducida por la inclusión del exón 7 en el final SMN2 transcripción y regulación al alza de la producción de proteína SMN. Una de las ventajas de usar mixmers LNA ADN para inducir la inclusión del exón es que la concentración efectiva para la transfección es significativamente menor que otros químicos13. Este método puede ser utilizado para muchos otros AONs excepto phosphorodiamidate morfolino oligómeros (PMOs), que, debido a su carga neutral, necesitan entrar en las células mediante endocitosis inducida por el reactivo de transfección Co Endo-Porter.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de evaluación en vitro descrito aquí es rápido, fácil y suficientemente sensibles para la prueba de varios AONs. Este protocolo es ampliamente aplicable a saltar del exón y la inclusión de otros genes y varios tipos de células. Además, la mayoría químicos AON (excepto PMOs) pueden transfected con este método. AONs pueden regular el splicing del pre-mRNA de genes endógenos y artificialmente introducidos y pueden ser co transfected con los vectores plásmidos portadores de genes específicos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Nicole McRorie para ayuda con los experimentos. Este trabajo fue financiado por la Universidad de Alberta Facultad de medicina y odontología Slipchuk SMA investigación Fundación beca de investigación, los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR), los amigos de Garrett Cumming investigación fondos, HM Toupin neurológica Fondos de investigación de la ciencia, la Distrofia Muscular de Canadá, la Fundación de Canadá para la innovación, Alberta empresa y educación superior y las mujeres y de niños Instituto de investigación de salud (WCHRI).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
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