تقييم إدراج إكسون الناجمين عن طريق لصق تبديل النوكليوتيد العقاقير في SMA المريض الليفية
Summary
أظهرت مختلف العقاقير النوكليوتيد (AONs) للحث على إدراج إكسون (تعديل الوصلة) وإنقاذ التعبير الجالي لضمور العضلات الشوكي (SMA). هنا، يمكننا وصف بروتوكول لايون ليبوترانسفيكشن للحث على إدراج إكسون في الجينات SMN2 وأساليب التقييم تحديد الكفاءة في SMA الليفية المريض.
Abstract
ضمور العضلات الشوكي (SMA)، أمراض عصبية قاتلة الناجمة عن فقدان SMN1، يمثل حالة فريدة من نوعها في المجال العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون)-بوساطة العلاج. بينما الطفرات SMN1 المسؤولة عن المرض، AONs استهداف مواقع كاتم الصوت (ISS) الوصلة إينترونيك في SMN2، بما في ذلك نوسينيرسين التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير، تبين أن استعادة التعبير الجالي والتخفيف من الأعراض. حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في رواية أيون كيمياء استهداف SMN2 التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. هنا، نحن وصف بروتوكول للتقييم في المختبر لإدراج إكسون باستخدام ليبوترانسفيكشن AONs متبوعاً بالنسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) والكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) النشاف الغربية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع مختلفة من أيون كيمياء. باستخدام هذا الأسلوب، نظهر أن AONs تتألف من الأحماض النووية مؤمنة التناوب (لناس) والنيوكليوتيدات الحمض الخلوي الصبغي (LNA/DNA ميكسميرس) يؤدي إلى كفاءة SMN2 إكسون إدراج واستعادة للبروتين الجالي في تركيزات منخفضة للغاية، وبالتالي، LNA/ الحمض النووي على أساس ميكسمير النوكليوتيد العقاقير قد تكون استراتيجية علاجية جذابة لعلاج الربط العيوب الناجمة عن الأمراض الوراثية. في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs رواية مختلفة.
Introduction
ضمور العضلات الشوكي (SMA) اضطراب عصبي عضلي فادح الموروثة في نمط مقهورة جسمية. ويتميز بتدهور الخلايا العصبية الحركية والجذع تدريجيا واطرافهم العضلات شلل1،2. غالبية الحوادث SMA سبب طفرة متماثل في الجينات البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 1 (SMN1)3. الجين البقاء على قيد الحياة للخلايا العصبية الحركية 2 (SMN2) تكرار معكوس من SMN1، وتسلسل متطابقة تقريبا تختلف حسب القواعد الخمس فقط4،5. تحول ج-إلى تي في SMN2 الواقعة في إكسون 7 يجعل الجين لا يعمل تقريبا نظراً للطفرة تؤدي إلى إكسون الأساسية 7 استبعادهم في ما يقرب من 90 في المائة من SMN2 المحاضر الحرفية (الشكل 1). لا يمكن أن تعوض مرناس SMN2 إكسون 7 في عداد المفقودين للدالة SMN1 لأن ناتجها البروتين غير مستقرة وتتحلل سريعاً.
العلاج بالعقاقير برزت مؤخرا كاستراتيجية واعدة جداً لعلاج SMA6. الموافقة الأخيرة على نوسينيرسين من “الولايات المتحدة للأغذية” والدواء (FDA) إتاحته أول دواء لعلاج SMA7. نوسينيرسين هو 18-مير العقاقير اليغنوكليوتيد (أيون) مع تعديل 2 ‘-O-ميثوكسييثيل (وزارة التربية والتعليم) والعمود الفقري فوسفوروثيواتي. المخدرات يستهدف كاتم الصوت الربط إينترونيك N1 (المحطة الفضائية الدولية-N1) يقع في إنترون 7 الجين SMN2 . ملزمة نوسينيرسين إلى محطة الفضاء الدولية-N1 يعزز الانتعاش وظيفية كاملة الطول الجالي البروتين التعبير من الجينات SMN2 الذاتية بحمل إكسون 7 إدراج (الشكل 1)8،9،10 . حاليا، العديد من الدراسات التي تشمل العلاج بايون ل SMA التركيز على التحقيق في كيمياء أيون الرواية التي قد تكون أكثر فعالية وأقل سمية من نوسينيرسين. وقد ثبت أن AONs مع كيمياء أخرى أيضا كفاءة الحث على إدراج إكسون في SMN2 إكسون 7 في المختبر و في فيفو11،،من1213.
مؤمن من الأحماض النووية (لناس) هي النظير الحمض النووي الريبي معدلة كيميائيا تحتوي على جسر الميثيلين الاتصال 4-الكربون مع 2 ‘-الأكسجين داخل ال14،فرانس الهيكل (الشكل 1ب)15. بالمقارنة مع السلطات الوطنية المعينة أو الكشف، لناس زيادة تقارب للربط لتسلسل الحمض النووي الريبي مكملة ولها فائدة مضافة ليجري شديدة المقاومة ل nucleases الذاتية. تم تطبيق الكيمياء LNA لاستخدامها كمجسات للأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) وفي قبكر16،17. كما أنها تستخدم لتنظيم التعبير الجيني في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. AONs جابمير مزيج من جزيئات الحامض النووي الذين تقطعت بهم السبل-واحد يحف به عدة لناس في نهايات 3 ‘و 5’. نهدم التعبير الجيني بالربط مكملة مرناس المستهدفة، مما أدى إلى أن يتحلل من “ح رناسي” المنشط18. ميكسميرس LNA/الحمض النووي هي AONs التي تتكون من الحمض النووي النيوكليوتيدات تدمج ما بين لناس. قدم في هذا الاتجاه أنهم ربط ميرنا تمنع عن وظيفة (LNA-أنتيمير)19. وصلت بعض LNA-أنتيميرس التطوير السريري. للحصول على أمثلة، ميرافيرسين (أنتيمير-122) أنتيمير LNA الذي يمنع مير-122 لعلاج الإصابة بالتهاب الكبد الوبائي وهي عدة “المرحلة الثانية من” التجارب السريرية الجارية حاليا19،20. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن ميكسميرس LNA/الحمض النووي يمكن أن تعدل أيضا الجيش الملكي النيبالي الربط21. ويمكن ربط تسلسل محدد من مرناً وحمل إكسون تخطي في إدراج ديستروفين مرناً واكسون في SMN2 مرناً في المختبر13،22.
في هذه المقالة، نحن مخطط منهجية لاستحثاث إكسون إدراج استخدام AONs وتقييم كفاءة المستويات الرنا والبروتين. لتجسيد هذا الأسلوب، استخدمنا ميكسميرس LNA/الحمض النووي استهداف المحطة الفضائية الدولية-N1 في إنترون 7 من SMN2. AONs transfected في خلايا المريض SMA قبل ليبوترانسفيكتيون الناجمة عن إدراج إكسون 7 في النهائي SMN2 نسخة و upregulation من إنتاج البروتين الجالي. واحدة من مزايا استخدام ميكسميرس LNA/الحمض النووي للحث على إدراج إكسون أن تركيز فعال تعداء أقل بكثير من غيرها كيمياء13. يمكن استخدام هذا الأسلوب للعديد من AONs الأخرى باستثناء ليغومرات morpholino فوسفورودياميداتي (بالرصدات)، التي، بسبب تهمة محايدة، بحاجة إلى إدخال الخلايا عن طريق الالتقام الناجمة عن الكاشف تعداء المشارك إندو-بورتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
في المختبر تقييم الأسلوب الموصوفة هنا سريعة وسهلة وحساسة بما يكفي لاختبار AONs مختلف. هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق على نطاق واسع لتخطي إكسون وإدراج جينات أخرى ومختلف أنواع الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ترانسفيكتيد معظم أيون كيمياء (باستثناء موظفي) باستخدام هذا الأسلوب. AONs يمكن ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون نيكول مكروري للحصول على مساعدة التجارب. هذا العمل كان تدعمها جامعة ألبرتا كلية الطب وطب الأسنان، منحة بحثية مؤسسة البحوث SMA سليبتشوك، المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا)، أصدقاء أموال البحث غاريت كومينغ، العصبي توبين جلالة أموال البحث العلمي، أن كندا ضمور العضلات، ومؤسسة كندا للابتكار، والمؤسسة ألبرتا والتعليم المتقدم، والنساء والأطفال معهد البحوث الصحية (وتشري).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2′-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2′-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
