Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten
Summary
Verschiedenen antisense Oligonukleotide (AONs) haben gezeigt, zu induzieren Exon Aufnahme (Spleiß-Modulation) und SMN Ausdruck für Spinale Muskelatrophie (SMA) zu retten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für AON Lipotransfection, Exon Aufnahme in das SMN2 -gen und die Bewertungsmethoden zu ermitteln, die Wirksamkeit bei SMA Patienten Fibroblasten zu induzieren.
Abstract
Spinaler Muskelatrophie (SMA), eine tödliche neurologische Erkrankung, verursacht durch den Verlust des SMN1, präsentiert einen einmaligen Fall in das Feld der antisense-Oligonukleotid (AON)-Therapie vermittelt. Während SMN1 Mutationen für die Krankheit verantwortlich sind, AONs targeting intronischen Spleißstellen Schalldämpfer (ISS) in SMN2, einschließlich der FDA-zugelassene Nusinersen haben gezeigt, dass Wiederherstellung SMN Ausdruck und die Symptome zu lindern. Derzeit konzentrieren sich viele Studien mit AON-Therapie für SMA auf neuartige AON Chemikalien SMN2 , die effektiver und weniger toxisch als Nusinersen möglicherweise gezielt zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- Bewertung der Exon-Aufnahme mit Lipotransfection von AONs gefolgt von reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und westliche Beflecken. Diese Methode kann für verschiedene Arten von AON Chemikalien eingesetzt werden. Mit dieser Methode, wir zeigen, dass AONs bestehend aus abwechselnd gesperrt Nukleinsäuren (LNAs) und DNA-Nukleotide (LNA/DNA-Mixmers) zu effizienten SMN2 Exon Aufnahme und Wiederherstellung des SMN-Protein zu einem sehr niedrigen Konzentration und daher LNA führen / DNA-Mixmer-basierte antisense Oligonukleotide möglicherweise eine attraktive therapeutische Strategie, Spleißen Defekte, die durch genetische Krankheiten zu behandeln. Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen neuartigen AONs.
Introduction
Spinaler Muskelatrophie (SMA) ist eine tödliche neuromuskuläre Erkrankung in einem autosomal rezessive Muster vererbt. Es zeichnet sich durch den Abbau von Motoneuronen und progressive Stamm und Gliedmaßen Muskel Paralyse1,2. Die Mehrheit der SMA Vorkommen sind eine homozygote Mutation im Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gen3. Das Überleben der Motor Neuron 2 (SMN2) Gen ist eine inverse Duplikat des SMN1und hat eine fast identische Sequenz unterscheiden sich durch nur fünf Basen4,5. Ein C-to-Tape-Übergang in SMN2 befindet sich im Exon 7 macht das Gen fast nicht funktionsfähig, weil die Mutation zu wesentlichen Exon 7 führt, in fast 90 % des SMN2 Transkripte (Abbildung 1(eine) ausgeschlossen. SMN2 mRNAs fehlende Exon 7 kann nicht für die SMN1 -Funktion auszugleichen, weil seine Proteinprodukt instabil ist und wird rasch abgebaut.
Antisense Therapie tauchte vor kurzem als eine sehr vielversprechende Strategie für die Behandlung von SMA-6. Die neue Zustimmung des Nusinersen durch die US Food and Drug Administration (FDA) das erste Medikament zur Verfügung gestellt für die Behandlung von SMA-7. Nusinersen ist ein 18-Mer antisense-Oligonukleotid (AON) mit einer 2′-O-Methoxyethyl-Modifikation (MOE) und ein Phosphorothioat Rückgrat. Das Medikament richtet sich an die intronischen Spleißen Schalldämpfer N1 (ISS-N1) befindet sich im Intron 7 des SMN2 Gens. Bindung von Nusinersen zur ISS-N1 fördert die Erholung der funktionalen Full-Length SMN-Protein-Expression von endogenen SMN2 Gens durch Induktion Exon 7 Aufnahme (Abbildung 1(eine)8,9,10 . Viele Studien mit AON-Therapie für SMA, konzentrieren sich auf die Untersuchung neuartiger AON-Chemikalien, die effektiver und weniger toxisch als Nusinersen möglicherweise. Es wurde nachgewiesen, dass AONs mit anderen Chemikalien auch effizient Exon Aufnahme in SMN2 Exon 7 induzieren in Vitro und in Vivo11,12,13.
Gesperrte Nukleinsäuren (LNAs) sind chemisch modifizierte RNA-Analoga, enthält eine Methylen-Brücke verbindet die 4 ‘ –Carbon mit dem 2′ –Sauerstoff in der Furanose-Struktur (Abb. 1b)14,15. Im Vergleich zu DNA oder RNA, LNAs haben eine erhöhte Affinität für die Bindung an komplementäre RNA-Sequenzen und haben den zusätzlichen Vorteil des Seins sehr widerstandsfähig gegen endogene Nukleasen. Die LNA-Chemie wurde für den Einsatz als Sonden für die Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) und qPCR16,17angewendet. Darüber hinaus wird es genutzt, um die Genexpression regulieren in Vitro und in Vivo. GapmeR AONs sind eine Kombination aus einsträngiger DNA-Moleküle, flankiert von mehreren LNAs an den 5 ‘ und 3 ‘ enden. Sie niederzuschlagen Genexpression durch Bindung ergänzen gezielte mRNAs, wodurch sie von der aktivierten RNase H18abgebaut werden. LNA/DNA Mixmers sind AONs, bestehend aus DNA Nukleotide zwischen LNAs integriert sind. Präsentiert in dieser Ausrichtung können sie binden, MiRNA, hemmen die Funktion (LNA-AntimiR)19. Einige LNA-AntimiRs haben klinischen Entwicklung erreicht. Zum Beispiel Miravirsen (AntimiR-122) ist ein LNA-AntimiR, die MiR-122 zur Behandlung von Hepatitis C-Infektion hemmt und mehrere klinische Phase II-Studien sind derzeit19,20. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass Mixmers LNA/DNA-RNA-Spleißen21auch modulieren kann. Es kann eine bestimmte Sequenz der mRNA zu binden und induzieren Exon-skipping bei Dystrophin mRNA und Exon Aufnahme in SMN2 mRNA in-vitro-13,22.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Induktion von Exon-Aufnahme mit AONs und die Bewertung der Wirksamkeit der RNA und Protein Ebene. Um diese Methode zu veranschaulichen, haben wir die LNA/DNA Mixmers targeting ISS-N1 im Intron 7 des SMN2verwendet. AONs transfiziert in SMA Patienten Zellen durch Lipotransfection induzierte Exon 7 Aufnahme in die endgültige SMN2 Transkript und Hochregulation des SMN-Protein-Produktion. Einer der Vorteile der Verwendung von LNA/DNA Mixmers induzieren die Exon-Aufnahme ist, dass die wirksame Konzentration für die Transfektion deutlich niedriger als andere Chemikalien13. Diese Methode kann für viele andere AONs außer Phosphorodiamidate Morpholino Oligomere (PMOs), verwendet werden, die aufgrund ihrer neutralen Ladung Zellen durch Endozytose induziert durch das Endo-Porter Co Transfection Reagens eingeben müssen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in-vitro- Bewertung hier beschriebene Methode ist schnell, einfach und empfindlich genug für die Prüfung von verschiedenen AONs. Dieses Protokoll ist auf Exon-skipping und Einbeziehung von anderen Genen und verschiedene Zelltypen. Darüber hinaus können die meisten AON Chemikalien (außer PMOs) transfiziert werden mit dieser Methode. AONs kann Spleißen der Pre-mRNA von endogenen und künstlich eingeführte Gene regulieren kann und mit Plasmid-Vektoren mit gezielten Genen Co transfizierten.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Nicole McRorie für Hilfe mit den Experimenten. Diese Arbeit wurde von der University of Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, der kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR), die Freunde von Garrett Cumming Forschungsmittel, HM Toupin neurologischen unterstützt. Wissenschaft Forschungsmittel, die muskulöse Dystrophie Kanada, Kanada Stiftung für Innovation, Alberta Enterprise und Weiterbildung, und die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
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